均一的成人骨髓源性神经干细胞的简捷获取

目的 探讨建立具均一性的、未分化且具有神经分化能力的成人骨髓源性神经干细胞（human adult bone marrow-derived neural stem cells,Md-NSCs）的有效获取方案。方法 抽取成人志愿者全骨髓,梯度离心分离成人骨髓基质细胞（human adult bone marrow stromal cells, hMSCs）,贴壁培养法纯化及扩增hMSCs;以神经干细胞培养基体外诱导培养hMSCs成为Md-NSCs,以诱导培养基于体外诱导培养Md-NSCs向神经系细胞分化;相差显微镜下观察 hMSCs及Md-NSCs的形态学特征;免疫组化法检测Md-NSCs中Nestin的表达,以及由 Md-NSCs诱导分化后得到的神经系细胞中GFAP、NG2及MAP2ab的表达。结果 传代纯化后的hMSCs呈梭形,贴壁生长,增殖旺盛。经10~15d诱导培养,hMSCs可分化为Md-NSCs,其形态为均一性的、呈球形的细胞克隆,不贴壁生长,增殖旺盛,并聚集成神经球结构,Md-NSCs克隆高度表达神经干细胞标志蛋白Nestin。经7~10天诱导培养,Md-NSCs于体外可分化成神经系细胞,分化细胞可表达星形胶质细胞标志蛋白GFAP、少突胶质细胞标志蛋白NG2及神经元细胞标志蛋白MAP2ab。 结论 通过本方案可简捷有效地获得均一的成人骨髓源性神经干细胞,可为体内移植治疗人类神经系统疾病提供丰富而理想的神经干细胞来源。     

白细胞介素1α与胶质细胞源神经营养因子不同组合对骨髓源性神经干细胞体外诱导分化的影响

目的：比较白细胞介素1α与胶质细胞源神经营养因子不同组合条件下骨髓基质细胞分化情况，探讨骨髓基质细胞诱导分化为神经干细胞及多巴胺能神经元的分化条件。方法：2005-03／09在解放军第一军医大学珠江医院全军神经医学研究所进行。①实验分组：实验分为空白对照组；胶质细胞源神经营养因子＋白细胞介素ld组，后者又分为10μg/L＋100ng/L,10μg/L＋200ng/L,20μg/L＋100ng/L,20μg/L＋200ng/L,1000μg/L＋100ng/L组。②细胞模型制作：用全骨髓法培养骨髓基质细胞。③骨髓基质细胞以5&;#215;10^8L^-1接种，悬浮于本实验室配制的神经干细胞培养基中。空白对照组：血清终浓度为体积分数为0．1的胎牛血清。细胞接种48h后，胶质细胞源神经营养因子＋白细胞介素1α各组分别加人相应质量浓度的胶质细胞源神经营养因子＋白细胞介素1α。④应用Olympus光学显微镜观察细胞抗-神经巢蛋白和D2受体阳性染色阳性细胞数目计数。结果：①加人胶质细胞源神经营养因子、白细胞介素1α增殖培养48h可见细胞分裂相。②诱导6d，部分细胞有神经巢蛋白成分表达。③3周测出DA受体D2检测阳性，胶质细胞源神经营养因子＋白细胞介素1α 10μg/L＋100ng／L组细胞诱导分化率显著高于10μg/L＋200ng／L，20μg/L＋100ng／L，20μg/L＋200ng／L，1000μg/L＋100ng／L组及空白对照组[依次为：（11.70&;#177;0.55）％，（3.62&;#177;0．78）％，（4．14&;#177;0．41）％，（3.3&;#177;0．63）％，（4．92&;#177;0．34）％，（1．61&;#177;0．68）％，P〈0．05或0.01].结论：骨髓基质细胞在体外培养条件下，经过胶质细胞源神经营养因子、白细胞介素1α诱导分化作用，配合使用高浓度（体积分数为0．1）血清可获得巢蛋白阳性的神经前体细胞及表达D2受体阳性的多巴胺能神经元；10μg/L＋100ng／L为最佳诱导分化质量浓度。     

猫骨髓源神经干细胞的诱导分化

目的观察家猫骨髓源巢蛋白阳性细胞诱导分化情况,为家猫骨髓基质细胞(BMSC)作为自体神经干细胞种子细胞提供理论依据。方法抽取家猫的骨髓,从中分离得到骨髓基质细胞,在体外给予神经干细胞培养基培养增殖,然后用分化诱导因子进行诱导分化,倒置相差显微镜下观察活细胞及免疫细胞化学染色情况。结果猫骨髓基质细胞在体外培养中体型增大,继之出芽,贴壁生长,可形成克隆团,同时可传代培养,这些具有克隆能力的骨髓基质细胞能表达神经干细胞特异性抗原巢蛋白,与5-溴尿嘧啶(BrdU)共培养3d后可见部分大圆形细胞BrdU染色阳性,这些细胞经进一步的诱导可分化为神经元样细胞,而且表达神经元特异性抗原NSE和NeuN。结论家猫骨髓基质细胞具有干细胞特征,可诱导为巢蛋白阳性细胞,并可进一步分化为表达烯醇化酶(NSE)和NeuN的神经元样细胞。证实家猫BMSC可作为移植修复神经系统损伤的神经干细胞种子细胞。     

菲立磁胞内标记食蟹猴骨髓基质细胞*

背景: 有关利用菲立磁体外细胞标记研究选择的动物主要是啮齿类动物,而研究灵长类动物食蟹猴的报道目前仍是空白。 目的：观察利用菲立磁和转染试剂体外磁性标记食蟹猴骨髓基质细胞方法的可行性。 方法：无菌条件下取食蟹猴骨髓,梯度密度离心法分离获取骨髓基质细胞,使用菲立磁-多聚赖氨酸复合物标记骨髓基质细胞,普鲁士蓝染色、电镜和锥虫蓝排除实验等方法鉴定菲立磁-多聚赖氨酸复合物标记食蟹猴骨髓基质细胞的效率和细胞的活力,倒置相差显微镜和免疫细胞化学方法检测骨髓基质细胞的增殖和分化能力。 结果与结论：菲立磁可以高效率地标记骨髓基质细胞,标记效率在99%左右。光镜和电镜下骨髓基质细胞胞质内分别可见细小的蓝色铁颗粒和许多包裹铁颗粒的囊泡。菲立磁-多聚赖氨酸复合物标记对骨髓基质细胞的活力、增殖和分化等能力没有明显影响。提示菲立磁可以用来体外标记食蟹猴骨髓基质细胞。     

成人骨髓源性神经干细胞中nestin表达的实时定量RT—PCR检测

目的建立快速获取成人骨髓源性神经干细胞（Human adult bone marrow—derived neural stem cells,Md—NSCs）的方法,并对Md—NSCs中神经巢蛋白nestin的表达进行定量比较分析。方法抽取成人志愿者全骨髓,梯度离心分离成人骨髓基质细胞（human adult bone marrow stromal cells,hMSCs）,贴壁培养法纯化及扩增hMSCs;以神经干细胞培养基体外诱导培养hMSCs成为成人骨髓源性神经干细胞（Human adult bone marrow—derived neural stem cells,Md—NSCs）;以实时定量RT—PCR检测Md—NSCs中nestin基因的表达,以hMSCs作为对照组。结果hMSCs呈长梭形,贴壁生长,于体外诱导培养可快速有效地获取Md—NSCs,Md—NSCs不贴壁生长,由神经干细胞克隆组成神经球样结构;Md—NSCs中nestin基因的表达比hMSCs增高2．04×10^2倍。结论hMSCs经诱导分化成为Md—NSCs后细胞的生物特征发生显著改变,Md—NSCs高度表达神经巢蛋白nestin具有神经干细胞的特征,并非hMSCs的简单聚集成球。     

大鼠脂肪基质细胞的分离培养及二步法诱导分化神经细胞

目的 研究脂肪基质细胞体外培养扩增及向神经细胞诱导分化的新方法.方法 取SD大鼠的腹膜后脂肪组织,以Ⅰ型胶原酶消化离心,含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基重悬细胞,增殖传代,取第5代细胞进行二步法诱导分化.首先以无血清Neurobasal培养基联合应用碱性成纤维细胞生长因子(bFGF) 20 ng/mL、表皮生长因子(EGF)20 ng/mL和N2(1:100)添加剂将细胞先诱导成神经球;再取第二代神经球加入1%胎牛血清、5%马血清、0.5μmol/L的维甲酸(RA)和50ng/mL脑源性神经营养因子(BDNF),促进其向神经元和胶质细胞方向分化;免疫荧光染色鉴定细胞分化结果.结果 初接种的细胞大多呈圆球状,悬浮在培养基中,24 h后贴壁.随着细胞密度加大,形态变成单层成纤维样细胞,呈漩涡状排列.无血清Neurobasal培养基诱导5～7 d可见悬浮的神经球出现;神经球迅速增殖,14d时直径可达100μm.分化后的大部分细胞呈现典型的神经元样改变,细胞体为圆形,内可见明显的细胞核,细胞伸出细长突起或网状突起,可见较多的细胞形成网络连接.免疫荧光染色鉴定结果证实,除了神经球可以高表达巢蛋白(nestin)(阳性率75.62%±1.34%)之外,分化细胞还可有效表达β-mbulinⅢ(未成熟神经元标记物,阳性率达57.62%±4.92%)或微管相关蛋白2(MAP2ab)(成熟神经元标记物,阳性率11.25%±3.87%);有少量细胞表达胶质纤维酸性蛋白(GFAF)(阳性率18.34%±3.87%)和GalC(阳性率14.35%+3.98%).结论 从成年大鼠脂肪中分离得到的脂肪基质细胞可在体外培养得到大量分化潜能稳定的子代细胞.应用本实验二步诱导法,可得到较高比例的nestin及β-mbulinⅢ阳性细胞,并有一定比例MAP2ab阳性细胞出现.     

不同方法诱导大鼠脂肪基质细胞定向分化为神经细胞的比较研究

目的 探索提高大鼠脂肪基质细胞(ADSCs)向神经细胞定向诱导分化比例的实验方法.方法 根据所采用的不同细胞诱导分化方法分为A组(直接诱导组:以含血清及神经营养因子的Neurobasal培养基直接诱导ADSCs向神经细胞分化)和B组[神经球诱导组:先以无血清Neurobasal培养基将ADSCs诱导为神经干细胞(NSCs)球,再以含血清及营养因子的Neurobasal培养基诱导神经球干细胞向神经细胞分化].通过细胞形态学观察以及免疫细胞化学检测巢蛋白(nestin)、β-微管蛋白Ⅲ(β-tubulinⅢ)、微管相关蛋白2(MAP2ab)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达,鉴定细胞分化结果.结果 免疫细胞化学结果证实,两组细胞均有效表达nestin和β-tubulinⅢ.A组细胞在诱导6 h时nestin表达可达高峰(73.8%±6.5%),并很快下降(24 h为50.3%±3.8%,72 h为10.5%±3.0%),72 h后即检测不到;β-tubulinⅢ在诱导后24 h开始表达(33.5%±6.6%),1周达高峰(84.3%±33%).B组nestin的高表达持续整个神经球阶段,β-tubulinⅢ在神经球阶段有少量表达(成球后7 d为14.1%±3.3%),神经球细胞分化后其表达明显增加(分化后3 d为46.4%±6.1%);B组存由NSCs向神经细胞诱导一定时间后可检测到一定比例的MAP2ab阳性细胞(24.5%).结论 ADSCs在体外稳定扩增传代并在适宜诱导条件下,可以向神经细胞定向分化.应用神经球诱导法和直接诱导法均可得到较高比例的nestin及β-tubulinⅢ阳性细胞,神经球诱导组nestin表达稳定,并有一定比例MAP2ab阳性细胞出现.     

大鼠骨髓基质细胞的培养及其表面抗原的检测

目的：分离、纯化培养大鼠BMSCs，对其生物学特性进行检测和鉴定。方法：取大鼠长骨中的骨髓组织，以淋巴分离液梯度离心获得有核细胞层，分别以本实验室BMSCs专用培养基接种培养，经多次换液得到较纯的BMSCs，倒置相差显微镜下观察细胞形态。选择CD44、CD31、CD45、CD29、CD34及flk1，应用流式细胞仪对细胞的表面抗原标志进行检测。结果：倒置相差显微镜观察发现，接种后的24h内，有核细胞（包含骨髓基质细胞）开始贴壁，4-7d，贴壁细胞出现明显分裂增殖，10-14d细胞增殖旺盛，可见明显的细胞克隆团，贴壁牢靠。20d左右，在本实验室专用BMSCs培养基培养下，绝大多数细胞逐渐分化呈梭形、三角形或多角形，核为圆形或类圆形、居中，这些细胞发出的突起逐渐生长延伸并彼此相连，形态学上具有神经系细胞的明显特征。细胞表面抗原检测显示所培养的BMSCs为：CD34^-、CD45^-、CD31^-、flk1^-、CD29^＋、CD44^＋，与文献报道一致。结论：所采用的细胞分离培养方法简便可行，所获得的细胞其表型特征与文献报道一致，确为BMSCs。     

骨髓基质细胞体外诱导分化成神经元和胶质细胞

目的　探索骨髓基质细胞 (bonemarrowstromalcells,BMSC)体外诱导分化为神经元和神经胶质细胞的可行性 ,为BMSC在神经科学领域内的应用奠定基础。方法　以成年犬BMSC为实验对象 ,利用碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)、表皮生长因子 (EGF)、维甲酸 (RA)、脑源性神经营养因子 (BDNF)、胶质细胞系来源神经营养因子 (GDNF)等作为增殖及分化诱导因子 ,进行增殖培养、分化诱导 ;免疫组化法进行细胞性质鉴定。结果　加入bFGF、EGF增殖培养 72h可见细胞分裂相 (成纤维细胞样细胞 )。加入RA、BDNF、GDNF诱导 3d ,部分细胞有NSE、GFAP成分表达 ;第 10d可见有神经元、神经胶质形态样细胞形成 ,经细胞成分 (NSE、GFAP)鉴定证实为神经元、神经胶质细胞。结论　BMSC在体外培养条件下 ,经过bFGF、EGF、RA、BDNF、GDNF等因子的“程序性”作用 ,可以分化成神经元和神经胶质细胞     

5-氨基乙酰丙酸介导的光动力对人脑胶质瘤细胞的治疗作用

目的探讨5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)介导的光动力学对人脑胶质瘤U251细胞的治疗作用方法使用荧光显微镜及共聚焦显微镜检测5-ALA所产生的光敏剂原卟啉(PpIX)在U251细胞中的定位。将5-ALA加入U251细胞中,随之以635nm的激光辐射,使用MTT法测定细胞生存率结果5-ALA与U251细胞共培养可以产生光敏剂原卟啉。原卟啉弥散地分布在U251细胞的胞浆中,胞核区未见分布。5-ALA介导的光动力对人脑胶质瘤U251细胞的杀伤作用随着5-ALA与U251细胞孵育时间的延长及5-ALA浓度的增加而增加,但在孵育6h、5-ALA浓度为2mmol/L时达饱和。而单用5-ALA或单纯激光辐射,对U251细胞无明显的杀伤作用。结论5-ALA介导的光动力治疗是很有前途的人脑胶质瘤治疗方法,5-ALA与U251细胞孵育的最佳时间为6h,最佳5-ALA药物浓度为2mmol/L