人骨髓基质细胞分化为神经元样细胞的研究

目的:探讨人骨髓源性神经干细胞分化为神经细胞的可行性,为中枢神经组织损伤修复寻找种子细胞的理想来源。方法:无菌取成人髂骨骨髓,密度梯度离心分离后获得骨髓基质细胞(bonemarrowstroualcells,BMSCs);在神经干细胞培养液及细胞因子等条件下诱导为神经元样细胞,通过免疫细胞化学方法对诱导后细胞进行鉴定;通过高效液相色谱法(HPLC)检测诱导后细胞合成分泌神经递质去甲肾上腺素(NE)的能力。结果:分离得到的成人BMSCs培养10～14d后,细胞呈半贴壁状,胞体饱满,Nestin抗原染色阳性。培养20d后,在诱导因子作用下进一步分化为神经元样细胞(NLCs),具有细长双极或多极突起,神经核蛋白(NeuN)抗原表达阳性。HPLC检测BMSCs、空白神经干细胞培养液未测到NE,经体外诱导培养8,11d的神经干细胞、体外诱导分化20d的NLCs均可检测到NE,神经干细胞(8,11d)的NE含量为(10.4146±1.0425),(28.3359±3.8371)μg/L小于NLCs(20d)组(52.1342±3.9136)μg/L,差异有非常显著性意义(F=126.64,P=0.0000)。而且随着BMSCs培养天数的增加,其所含的NE浓度也渐增加(P<0.05)。结论:在适宜培养条件及诱导因子联合作用下,人BMSCs可被成功诱导为神经细胞,并具有合成分泌神经递质成分的能力。     

Up-regulation of the transient A – type K+ current (IA) in the differentiation of neural stem cells of the early postnatal rat hippocampus

Background Neural stem cells (NSCs) not only are essential to cell replacement therapy and transplantation in clinical settings, but also provide a unique model for the research into neurogenesis and epigenesis. However, little attention has been paid to the electrophysiological characterization of NSC development. This work aimed to identify that whether the morphological neuronal differentiation process in NSCs included changes in the electrophysiological properties of transient A-type K+ currents (IA). Methods NSCs were isolated from early postnatal rat hippocampus and were multiplied in basic serum-free medium containing basic fibroblast growth factor. Potassium currents were investigated using whole-cell patch-clamp techniques. Results Compared to NSC-derived neurons, cNSCs (cloned NSCs) had a more positive resting membrane potential, a higher input resistance, and a lower membrane capacitance. Part of cNSCs and NSC-derived neurons possessed both delayed-rectifier K+ currents (IDR) and IA, Steady-state activation of IA in cNSCs (half-maximal activation at 21.34±4.37 mV) occurred at a more positive voltage than in NSC-derived neurons at 0–6 days in vitro (half-maximal activation at 12.85±4.19 mV). Conclusions Our research revealed a developmental up-regulation of the IA component during differentiation of postnatal NSCs. Together with the marked developmental up-regulation of IDR in vitro neuronal differentiation we have previously found, suggest that the voltage-gated potassium channels may participate in neuronal maturation process.     

红藻氨酸作用后海马神经元胞膜表面的超微结构的原子力显微镜观察

目的 观察原代培养神经元在红藻氨酸(KA)作用下细胞表面形态的三维构像变化。方法 利用原子力显微镜(AFM)对大鼠海马神经元经不同浓度的KA(25和250μmol／L，50和100nmol／L)分别作用10min和100min后的表面结构进行纳米级水平扫描和观测。结果 正常海马神经元表面光滑，起伏均匀、规律；KA作用后神经元呈退行性改变，表现为胞体肿胀，胞膜表面粗糙，出现隆起和“孔洞”样结构，并且其变化程度分别与作用时问和KA浓度呈量-效关系。结论 KA对海马神经元毒性作用后胞膜表面超微结构所产生的明显变化，可借助AFM清晰观察，并定量分析。     

菲立磁标记兔骨髓基质源神经干细胞自体移植入纹状体后的形态学观察

目的将体外标记的骨髓基质源神经干细胞经单细胞悬液微移植后观察其在兔纹状体的存活、迁移、分化和整合情况，为细胞移植治疗疾病奠定基础。方法分离兔骨髓基质细胞，利用神经干细胞培养基、白血病抑止因子和碱性成纤维母细胞生长因子进行细胞扩增并诱导成骨髓基质源神经干细胞，再经菲立磁和活细胞荧光染料PKH67标记后．采用微移植的方法，通过脑立体定位仪，用微玻璃针将干细胞分别植入兔脑纹状体内。存活1、4、8周后处死动物，组织切片，利用光镜和电镜观察标记细胞在脑内的形态学情况。结果菲立磁标记的兔骨髓基质源神经干细胞经微移植后可在兔脑内纹状体区域存活，移植的干细胞可向周围的脑实质内迁移和整合，迁移细胞沿特定的纹状体结构分布。少量菲立磁标记的干细胞可以分化成神经元。结论骨髓基质源神经干细胞移植后．可在脑实质内存活、迁移、分化和整合，这种细胞可能成为中枢神经系统自体移植的细胞来源。     

骨髓源性神经干细胞去甲肾上腺素神经递质变化的实验研究

目的研究骨髓源性神经干细胞在体外培养及诱导分化条件下能否分泌去甲肾上腺素(NE).方法分离兔骨髓基质细胞(BMSCs),在体外应用神经干细胞培养液和诱导分化因子使其分化为神经干细胞及神经元样细胞,采用免疫细胞化学方法进行鉴定;应用高效液相色谱法(HPLC)检测其NE的含量.结果BMSCs培养7～14 d免疫细胞化学鉴定Nestin抗原阳性;培养20 d可见长突起神经元样细胞,神经核蛋白(NeuN)呈阳性表达;HPLC检测神经干细胞培养液及L-02肝细胞等阴性对照组及BMSCs(0～5 d)组未检测到NE,骨髓源性神经干细胞(培养7 d、14 d)及神经元样细胞(培养20d)均可检测到NE.随着培养天数的增加,所含的NE浓度也逐渐增加(P＜0.01).结论在适宜条件下,兔BMSCs可在体外分化成神经干细胞及神经元样细胞,并合成和分泌NE.     

人骨髓基质细胞核移植重构胚的建立

目的建立人体细胞核移植技术，为治疗性克隆的实验研究及临床应用奠定基础。方法应用显微操作技术将单个人骨髓基质细胞注入去核后的兔卵母细胞内，经电融合、离子霉素和6．甲氨基嘌呤激活后．培养于含10％胎牛血清的TCM-199中，使重构胚进一步发育至囊胚。结果245枚卵母细胞进行去注核显微操作，核移植后有72．6％（178／245）卵母细胞仍保持完整；经电融合后细胞融合率为62．8％（83／132）：体外培养后约65％（54／83）的重构胚可进入分裂期，3．7％（2／54）发育至桑囊期，囊胚孵化率为100％（2／2）。结论兔卵母细胞能使人骨髓基质细胞核重新编程形成核移植重构胚并可继续发育至囊胚，使得从核移植重构囊胚分离胚胎干细胞用于实验和临床治疗研究成为可能。     

绿色荧光蛋白基因腺病毒载体转染人骨髓间充质干细胞的实验研究

目的研究绿色荧光蛋白基因（Ad—GFP）腺病毒载体在人骨髓间充质干细胞（BMSCs）转染和表达的量效关系及对细胞生物学特性的影响．探讨用该载体构建基因修饰BMSCs的可行性。方法在体外分离培养人BMSCs，流式细胞仪检测细胞免疫表型，293细胞包装制备病毒，以不同滴度的Ad—GFP（1×10^3-1×10^10PFU／mL）转染BMSCs．细胞计数法分析转染率．倒置显微镜观察细胞形态学改变．CCK8法检测细胞增殖活性，用血清撤离加入β-巯基乙醇诱导转染Ad—GFP的BMSCs向神经元样细胞定向分化。结果3～6代BMSCs表面标志CD34、CD45呈阴性而CD29、CD44呈阳性：当病毒滴度为1×10^7PFU／mL时转染率为55％，1×10^9及1×10^10PFU／mL滴度时转染率均为85％，但1×10^10PFU／mL滴度时出现细胞病理现象；7d荧光表达最强，28d仍可见荧光表达。荧光显微镜下可见表达Ad—GFP的BMSCs有三种亚群结构：滴度≥1×10^6PFU／mL时，BMSCs增殖在早期受到抑制，且呈剂量依赖；转染Ad—GFP的BMSCs经β一巯基乙醇诱导可分化为神经元样细胞，神经元特异性烯醇化酶（NSE）阳性。结论合适滴度的Ad—GFP可以高效转染BMSCs，对细胞的生物学特性影响较小，不影响诱导分化功能，BMSCs可以作为用Ad—GFP载体系统进行基因治疗研究的种子细胞。     

骨髓源性神经干细胞自体移植对癫(癎)大鼠海马的修复作用

目的 探讨骨髓源性神经干细胞自体移植对癫(癎)大鼠海马的修复作用.方法 雄性SD大鼠随机分为正常对照组、移植组和非移植组.无菌条件下分离大鼠骨髓基质细胞,在特定条件下培养、诱导其分化为神经干细胞;对移植组和非移植组大鼠建立颞叶癫(癎)模型,将诱导分化的神经干细胞自体移植至移植组大鼠右侧海马内,观察移植后1周、2周、4周、8周和16周模型鼠海马的形态学变化.结果 移植组与非移植组海马CA3区锥体细胞数各时间点显著少于正常对照组(均P＜0.01);与非移植组比较,移植组海马CA3区锥体细胞数于移植后第2～16周明显增多(均P＜0.01);移植组各时间段之间差异有统计学意义(均P＜0.01).与正常对照组相比,移植组和非移植组海马损伤侧的Timm染色评分显著增高(均P＜0.01);但移植组移植2周后各时间点评分显著低于非移植组(均P＜0.01);非移植组随制模时间延长评分持续升高.MRI检查显示在神经干细胞移植后1周和2周时低信号改变区比较局限,此后低信号影随着时间的推移逐渐增大.结论 骨髓源性神经干细胞自体移植至癫(癎)大鼠后能够在海马中生存并迁移,具有减轻海马CA3区锥体细胞缺失、抑制海人酸引起的苔状纤维发芽的修复作用.     

猫骨髓源神经干细胞的诱导分化

目的观察家猫骨髓源巢蛋白阳性细胞诱导分化情况,为家猫骨髓基质细胞(BMSC)作为自体神经干细胞种子细胞提供理论依据。方法抽取家猫的骨髓,从中分离得到骨髓基质细胞,在体外给予神经干细胞培养基培养增殖,然后用分化诱导因子进行诱导分化,倒置相差显微镜下观察活细胞及免疫细胞化学染色情况。结果猫骨髓基质细胞在体外培养中体型增大,继之出芽,贴壁生长,可形成克隆团,同时可传代培养,这些具有克隆能力的骨髓基质细胞能表达神经干细胞特异性抗原巢蛋白,与5-溴尿嘧啶(BrdU)共培养3d后可见部分大圆形细胞BrdU染色阳性,这些细胞经进一步的诱导可分化为神经元样细胞,而且表达神经元特异性抗原NSE和NeuN。结论家猫骨髓基质细胞具有干细胞特征,可诱导为巢蛋白阳性细胞,并可进一步分化为表达烯醇化酶(NSE)和NeuN的神经元样细胞。证实家猫BMSC可作为移植修复神经系统损伤的神经干细胞种子细胞。     

菲立磁胞内标记食蟹猴骨髓基质细胞*

背景: 有关利用菲立磁体外细胞标记研究选择的动物主要是啮齿类动物,而研究灵长类动物食蟹猴的报道目前仍是空白。 目的：观察利用菲立磁和转染试剂体外磁性标记食蟹猴骨髓基质细胞方法的可行性。 方法：无菌条件下取食蟹猴骨髓,梯度密度离心法分离获取骨髓基质细胞,使用菲立磁-多聚赖氨酸复合物标记骨髓基质细胞,普鲁士蓝染色、电镜和锥虫蓝排除实验等方法鉴定菲立磁-多聚赖氨酸复合物标记食蟹猴骨髓基质细胞的效率和细胞的活力,倒置相差显微镜和免疫细胞化学方法检测骨髓基质细胞的增殖和分化能力。 结果与结论：菲立磁可以高效率地标记骨髓基质细胞,标记效率在99%左右。光镜和电镜下骨髓基质细胞胞质内分别可见细小的蓝色铁颗粒和许多包裹铁颗粒的囊泡。菲立磁-多聚赖氨酸复合物标记对骨髓基质细胞的活力、增殖和分化等能力没有明显影响。提示菲立磁可以用来体外标记食蟹猴骨髓基质细胞。