柔性肽串联四价Aβ15重组腺病毒的构建及纯化

目的构建并纯化含有柔性肽串联四价β-淀粉样蛋白（Aβ15）的重组腺病毒疫苗,用于老年性痴呆的预防和治疗。方法酶切获取带有IgGк轻链信号肽序列的柔性肽串联四价Aβ15基因,定向克隆于穿梭质粒pAdTrack-CMV中。通过与腺病毒骨架载体pAdeasy-1在细菌内同源重组形成重组腺病毒质粒pAd-4×Aβ15,转染人胚肾293细胞后包装成有感染能力的重组腺病毒颗粒（Ad-4×Aβ15）。Western检测4×Aβ15在培养液中的分泌表达。氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒Ad-4×Aβ15。结果 pAdTrack-4×Aβ15测序结果和预期一致,同源重组并经293细胞包装后形成重组腺病毒Ad-4×Aβ15,western检测4×Aβ15在培养上清中表达。经氯化铯密度梯度离心纯化后Ad-4×Aβ15病毒颗粒数约为4.6×1012 VP/mL。结论成功制备了重组腺病毒Ad-4×Aβ15,感染细胞证实其呈分泌表达,经氯化铯密度梯度离心纯化后得到高滴度的重组腺病毒。为老年性痴呆（Alzheimer’s disease,AD）的实验治疗打下基础。     

以β-淀粉样蛋白为靶的单价及二价真核表达载体的构建和表达

【目的】构建以β-淀粉样蛋白为靶单价及二价真核表达载体pcDNA3．1-Aβ1-42、pcDNA3．1-AB42x，并在真核细胞中表达目的蛋白。【方法】PCR法扩增编码B一淀粉样蛋白的目的基因，利用基因克隆技术构建单价及二价真核表达载体；应用酶切及测序鉴定真核表达载体构建成功后，用Western blot和细胞免疫组化染色检测其在真核细胞中的表达。【结果】相应的双酶酶切能够获得插入的目的基因片段（分别为137bp和269bp），测序未发现突变；Western blot结果可见两条约为4ku和8ku的条带，细胞免疫组化染色可见阳性细胞。【结论】单价及二价真核表达载体构建成功；真核表达载体能在真核细胞中表达出目的蛋白。     

新生期小鼠卡介苗接种后免疫因子的增龄性变化

目的检测卡介苗免疫后小鼠脑组织匀浆液和血清中细胞因子的变化,为进一步研究新生期卡介苗接种影响小鼠中枢神经系统神经发生的分子机制研究做准备。方法实验分1周、2周、3周3个时间点,将新生24 h内的SPF级C57BL/6小鼠随机分为卡介组和对照组,每组12只,分别在新生24 h内背部皮下注射卡介苗和PBS。分别在生后1周、2周、3周采用摘眼球法采血,之后冰上无菌取海马组织并匀浆。用ELISA酶联免疫吸附法,分别测各时间点各实验组小鼠脑组织匀浆和血清中的IL-1β、IL-4、IL-10和TNF-α含量。结果 (1)与对照组相比,接种后1周、2周、3周时,卡介组小鼠海马中细胞因子IL-4和IL-10均多于对照组(P<0.05),血清中IL-4多于对照组(P<0.05);IL-10在第1周和第2周多于对照组(P<0.05)。与对照组相比,接种后1周、2周、3周时,卡介组小鼠海马中细胞因子IL-1β和TNF-α均少于对照组,血清中TNF-α少于对照组;IL-1β在第1周和第2周于对照组(P<0.05)。(2)同一时间点海马中的细胞因子含量远多于血清中含量。(3)随时间的推进,海马和血清中IL-4和IL-10有降低趋势;而小鼠海马和血清中IL-1β和TNF-α有增加趋势。结论新生期接种卡介苗成功后,可致小鼠海马和血清中的细胞因子浓度发生动态改变:与对照组相比,海马和血清中IL-4和IL-10的含量升高,且随时间有下降趋势,但IL-1β和TNF-α的含量降低,且随时间有增加趋势。     

Aβ_(15)老年性痴呆疫苗接种小鼠的剂量优化研究

目的探讨Aβ15老年性痴呆疫苗接种Tg2576转基因小鼠及C57小鼠的最优化剂量。方法将本室前期制备的重组Aβ15疫苗分别以25.0、12.5及6.25μg三种剂量接种Tg2576转基因小鼠及C57小鼠,比较其诱导小鼠产生的抗体滴度大小;Western检测抗体与Aβ42结合的特异性;免疫组化检测小鼠产生的抗体是否能特异性结合老年斑。结果 25、12.5μg两种剂量均能诱导机体产生高滴度的抗体,6.25μg剂量未能诱导小鼠产生特性抗体;相同的接种次数下,C57小鼠产生的抗体滴度较Tg2576转基因小鼠高;接种小鼠产生的特异性抗体均能和Aβ42及老年斑结合。结论 Aβ15疫苗接种小鼠的最优化剂量为12.5μg,Tg2576转基因小鼠对Aβ疫苗有轻度免疫耐受。