正、反义β1,4半乳糖基转移酶-Ⅴ表达质粒的构建

目的探讨不同β1,4半乳糖基转移酶-Ⅴ(β-1,4-GalTV)表达水平的生物学意义,构建正、反义β-1,4-GalTV表达质粒.方法设计β-1,4-GalTV全长引物;提取小鼠脑总RNA,通过RT-PCR方法,得到全长β-1,4-GalTV基因片段,将其克隆到pGEM-T载体.再通过多克隆酶切位点,将β-1,4-GalTV全长序列克隆到pcD-NA 3.1表达载体中.设计反义引物,以pGEM-β-1,4-GalTV质粒为模板,将PCR产物克隆到pcDA3.1表达载体中.通过酶切和测序鉴定构建的质粒.结果通过酶切和测序证实,得到了正、反义β-1,4-GalTV表达质粒.结论正、反义β-1,4-GalTV表达质粒的构建,为进一步研究不同β-1,4-GalTV表达水平的生物学意义奠定基础.     

Cyclin D3正、反义表达质粒在淋巴瘤细胞系Raji中的转染与鉴定

目的 :构建人类cyclinD3正义和反义真核表达质粒 ,分别转染到淋巴瘤细胞系Raji细胞中 ,为探讨cyclinD3基因对淋巴瘤细胞生物学行为的影响提供研究基础。方法 :以Raji细胞总RNA为模板 ,通过RT -PCR获取cyclinD3全长cDNA ,克隆入 pGEM -T载体 ,再亚克隆到真核表达载体pcDNA3 .1中 ,构成含cyclinD3的表达质粒 pcD NA3 -cyclinD3。再运用DNA重组技术将cyclinD3基因反向克隆到pcDNA3 .1中 ,构建成cyclinD3反义表达质粒pcDNA3 -ascyclinD3。用脂质体介导的基因转染方法 ,将cyclinD3正、反义表达质粒和空质粒分别导入Raji细胞 ,经G418筛选建立稳定转染细胞株 ,用WesternBlot方法鉴定cyclinD3基因的表达。结果 :酶切鉴定和测序分析证实 ,实验成功构建了cyclinD3正、反义表达质粒。与转染cyclinD3正义表达质粒和空质粒的细胞相比 ,转染cyclinD3反义表达质粒的Raji细胞中cyclinD3表达水平下降。 结论 :正、反义cyclinD3在淋巴瘤细胞中的转染和表达 ,为进一步研究cyclinD3在淋巴瘤细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡中的作用奠定了基础     

大鼠脑组织中SSeCKS基因克隆

目的 :克隆胚胎大鼠脑组织中SSeCKS基因。方法 :采用RT -PCR法 ,从胚胎大鼠脑组织mRNA中扩增SSeCKS基因部分CDS区片段 ,克隆入T载体 ,筛选阳性克隆、酶切鉴定并经序列测定。结果 :RT -PCR法扩增出一特异产物与预期长度 44 6bp相符 ,DNA序列测序的结果与GenBank提供的已知序列 (U 2 3 14 6)比较 ,所克隆的SSeCKS基因片段与其中的 44 6bp完全相同 ,与SSeCKS基因 10 0 %同源。 结论 :采用RT -PCR和T载体技术获得了胚胎大鼠脑组织中的SSeCKS基因克隆     

结肠癌组织LSD1表达对结肠癌LoVo细胞转移潜能影响研究

目的：研究赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶1（1ysinespecificdemethylase1,LSD1）在人结肠癌组织中的表达,及其对人结肠癌LoVo细胞株转移潜能的影响。方法：收集2007—06—01—2011-08—3i南通大学附属医院52例结肠癌石蜡组织标本,免疫组化方法检测52例组织中LSD1的表达情况并分析其临床意义;瞬时转染LSD1特异性短发卡RNA（shRNA）干扰质粒下调LSD1的表达,通过细胞划痕实验、Transwell迁移实验和Transwell侵袭实验观察下调LSD1的表达后LoVo细胞迁移及侵袭行为的变化。结果：LSD1在结肠癌组织中阳性表达率为67．3％（35／52）,在癌旁组织中为37．5％（9／24）,X2=5．958,P=0．014。结合临床资料分析显示,LSD1的表达与分化程度（P=0．001）、淋巴结转移（P=0．011）及Duke分期（P=0．024）有关,而与患者性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤直径、大体类型、浸润深度及有无远处转移无关。细胞划痕结果显示,转染组细胞迁移能力明显受抑制;Transwell迁移实验结果显示,Control组和转染LSD1-shR—NA组穿过膜细胞数分别为220．25±6．75和40．875±1．813,转染LSD1-shRNA组穿过膜细胞数明显减少,2—3．787,P〈0．001;Transwell侵袭实验结果显示,Control组和转染LSD1=shRNA组穿过膜细胞数分别为222．75±6．25和33．625±1．75,转染LSD1-shRNA组穿过膜细胞数明显减少,z=3．782,P〈0．001。结论：LSD1表达与结肠癌的恶性程度及转移潜能密切相关,下调LSD1表达能抑制结肠癌LoVo细胞的转移潜能。     

RAP单克隆抗体的制备及其在胰腺癌中的表达

目的：制备受体相关蛋白(receptor-associated protein,RAP)单克隆抗体,研究人胰腺癌组织中RAP的表达与定位,探讨胰腺癌发生发展的病理机制。方法：运用基因重组技术及单克隆抗体技术制备抗RAP抗体。利用制备的抗RAP抗体,分别采用Western Blot和免疫组织化学检测并比较4例胰腺癌患者癌及癌旁组织中RAP的表达及分布。结果：抗RAP单克隆抗体能特异识别分子质量为44 ku的RAP蛋白。 Western Blot与免疫组织化学检测结果均显示RAP在胰腺癌组织中的表达明显高于癌旁组织。免疫组织化学分析还显示RAP表达主要分布在细胞的胞质,呈强阳性;RAP在组织间质中也有少量分布,呈弱阳性。RAP在胰腺癌组织中的高表达主要分布在癌巢。结论：RAP表达与胰腺癌的发生发展密切相关。     

鬼臼乙叉甙对星形胶质细胞瘤表达β1,4-半乳糖基转移酶的影响

目的研究鬼臼乙叉甙(Etoposlde，又称VP16)影响人星形胶质细胞瘤SHG-44细胞周期过程中，与N-糖链合成有关的β1，4-半乳糖基转移酶Ⅰ、Ⅱ、V(β-1，4-galactosyltransferaseⅠ、Ⅱ、Ⅴ，β—1，4-GalT—Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ)表达变化。方法首先应用流式细胞仪技术分析VP16处理SHG-44细胞过程中细胞增殖情况的变化，再采用Northern Blot方法分析处理过程中的SHG-44细胞中β—1，4-GaT—Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ的表达变化。结果流式细胞仪检测表明，细胞培养基加入120μmol／LVP161～6h后能引起SHG-44细胞的S期阻滞。Northern Blot显示，VP16作用1～6h过程中，β-1，4-GalT—Ⅰ、Ⅴ表达无显著变化。而β—1，4-GalT-Ⅱ表达在此过程中则有升高趋势。结论VP16能够引起星形胶质细胞瘤细胞SHG-44细胞周期改变过程中，β—1，4-GalT—Ⅰ、Ⅴ的表达无变化，而β—1，4-GalT-Ⅱ的表达明显升高。提示VP16引起肿瘤细胞周期改变，可能通过影响β-1，4-GalT-Ⅱ的表达，引起有关蛋白质的糖基修饰而实现的。     

人类细胞周期蛋白D3反义表达质粒的构建

目的：构建人类细胞周期蛋白D3(cyclin D3)反义表达质粒，为今后利用反义核酸阻断技术研究cyclin D3基因的功能提供基础。方法：运用DNA重组技术将人cyclin D3基因反向克隆到真核表达载体pcDNA3．1中，构建成cyclin D3反义表达质粒pcDNA3--ascyclinD 3。结果：通过酶切鉴定及测序分析证实，实验成功构建了人cyclin D3反义表达质粒。结论：cyclin D3反义表达质粒pcDNA3--ascyclin D3的成功构建，为进一步研究cyclin D3的生物学功能及其在肿瘤发生、发展、诊疗和预后中的作用奠定了基础。     

miR-let-7a调节PI3K/Akt信号通路抑制人系膜细胞增殖和炎症反应

为探究miR-let-7a对LPS诱导的人系膜细胞(human mesangial cell, HMC)增殖和炎症反应的影响及其通过调节PI3K/Akt信号通路发挥作用的机制,体外条件下用0.1μg/mL LPS处理HMC, CCK-8法检测各时间点细胞活性;Western blotting检测HMC增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)、凋亡相关蛋白BAX及信号通路蛋白PI3K、p-Akt的表达情况;qPCR检测细胞中miR-let-7a及炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6和Ⅳ型胶原蛋白mRNA的表达。转染miR-let-7a mimic或inhibitor改变HMC中miR-let-7a的表达,或使用抑制剂LY294002阻断HMC中PI3K/Akt信号通路,观察不同处理对HMC增殖、炎症反应及PI3K/Akt信号通路激活的影响。结果显示,LPS处理可诱导HMC增殖和炎症反应,抑制miR-let-7a的表达(均P<0.05)并激活PI3K/Akt信号通路(均P<0.01);与LPS组相比,过表达miR-l...     

CDK11P58和Cyclin D3在损伤后大鼠坐骨神经中的表达变化

为了探讨大鼠坐骨神经损伤对CDK11P58和Cyclin D3表达的影响,本实验将成年SD大鼠随机分为假手术组和夹伤组,运用Western blot结合免疫荧光组织化学双标技术,观察了坐骨神经损伤后坐骨神经夹伤段、脊髓腰膨大前角和伤侧腓肠肌内CDK11P58和Cyclin D3的表达变化.结果显示:(1)坐骨神经夹伤后,坐骨神经夹伤段及脊髓腰膨大前角、伤侧腓肠肌中的CDK11P58蛋白的表达先逐渐下降,后又逐渐上升;而Cyclin D3的表达无明显变化;(2)在假手术组的坐骨神经、脊髓腰膨大前角和腓肠肌内都可观察到CDK11P58和Cyclin D3的表达;而坐骨神经夹伤后,在上述部位可检测到CDK11P58的表达强度明显减弱,但Cyclin D3无明显变化;(3)免疫荧光双标结果显示CDK11P58和Cyclin D3在假手术组的坐骨神经、脊髓腰膨大前角和伤侧腓肠肌内都有共存;而在坐骨神经损伤后这种共存强度明显降低.以上结果提示,坐骨神经损伤可影响坐骨神经及脊髓腰膨大、伤侧腓肠肌内CDK11P58的表达,但对Cyclin D3无明显影响,表明CDK11P58可能在周围神经损伤和修复中发挥重要作用.     

ERK在LPS诱导大鼠雪旺氏细胞TNF-α表达中的作用

目的 研究细胞外信号调节激酶（ERK）对脂多糖（LPS）诱导的大鼠雪旺氏细胞肿瘤坏死因子-α（TNF-α）表达的作用。方法 采用Westernblot检测细胞中ERK激酶的活性；用ERK的特异性抑制剂（PD98059）预处理细胞后，ELISA检测细胞中TNF-α水平；RT-PCR检测细胞中TNF-α mRNA的表达；用免疫荧光双标法检测ERK的表达定位。结果 LPS可显著激活雪旺氏细胞中的ERK信号通路，其激活高峰在LPS刺激后30～45min，60min后ERK磷酸化水平开始逐渐下降；用PD98059预处理细胞后，可显著抑制细胞TNF-α以及TNF-α mRNA的产生；LPS刺激细胞后引起ERK磷酸化，PD98059可抑制该过程。结论 ERK信号通路的激活可能是LPS诱导TNF-α表达的前提。通过阻断细胞内信号转导通路来减少TNF-α及其他细胞因子的产生，为抑制周围神经损伤后的炎症以及免疫反应发生提供了一条新的思路。