SHG-44胶质瘤细胞表达β-1,-半乳糖基转移酶V后对鬼臼乙叉甙敏感性影响

目的研究鬼臼乙叉甙(Etoposide,P16)对表达β-1,-半乳糖基转移酶V(beta-1,-galactosyltransferase V,β-1,-GalT V)的SHG-44胶质瘤细胞死亡和凋亡的影响,为进一步探讨β-1,-GaIT V与化疗药物敏感性的关系莫定基础.方法通过流式细胞仪(FCM)和Hoechst 33258染色法,分析不同浓度的VP16处理转染了正义(GalTV-HA/SHG-44)、反义β-1,-GalT V(GaITV-AS/SHG-44)和空载体(Mock)的SHG-44细胞后细胞的凋亡和死亡情况.结果①低浓度的VP16(20 μmoL/L)处理24 h后,alTV-HA/SHG-44组的死亡细胞加上凋亡细胞的比例明显低于Mock组(t=4.550 6,＜0.01)和GalTV-AS/SHG-44组(t=5.086 5,＜0.001).GalTV-AS/SHG-44组的死亡细胞加上凋亡细胞比例明显高于Mock组(t=3.287 3,＜0.01).高浓度的VP16(120μmoL/L)处理48 h和72 h后,alTV-HA/SHG-44组死细胞所占比例明显低于Mock组(t=3.3664,P＜0.05;t=5.495 3,＜0.01)和GalTV-AS/SHG-44组(t=3.173 2,＜0.01;t=4.603 5,＜0.001).②MTr分析显示,P16处理48,2h后,alTV-HA/SHG-44组活细胞数明显高于Mock组(t=5.078 3,＜0.05;t=3.8923,＜0.01)和GalTV-AS/SHG-44组(t=4.566 7,P＜0.01;t=4.784 9,＜0.001).③VP16(20 μmoL/L)处理24 h后,用Hoochst 33258染色.镜下观察到死亡或者凋亡细胞中的细胞核仁及断裂的核片段呈新月形,或核固缩并深染.GalTV-AS/SHG-44组平均死亡和凋亡阳性率为41%,大大高于经同样处理的转染空载体和转染正义β-1,-GalT V的SHG-44细胞.结论β-1,-GalTV能够影响抗肿瘤药VP16的杀伤作用,过表达β-1,4-GalT V可以拮抗VP16的作用,为解释胶质瘤的化疗耐药性提供了新的依据.     

SHG-44胶质瘤细胞表达β-1，4-半乳糖基转移酶V后对鬼臼乙叉甙敏感性影响

目的：研究鬼臼乙叉甙(Etoposide，VP16)对表达β-1，4-半乳糖基转移酶V(beta-1，4-galactosyltransferase V，β-1，4-GaITV)的SHG-44胶质瘤细胞死亡和凋亡的影响，为进一步探讨β-1，4-GaIT V与化疗药物敏感性的关系奠定基础。方法：通过流式细胞仪(FCM)和Hoeehst 33258染色法，分析不同浓度的VP16处理转染了正义(GalT V-HA／SHG-44)、反义β-1，4-GalT V(GalT V-AS／SHG-44)和空载体(Mock)的SHG-44细胞后细胞的凋亡和死亡情况。结果：①低浓度的VP16(20μmoL／L)处理24h后，GalT V-HA／SHG-44组的死亡细胞加上凋亡细胞的比例明显低于Mock组(t=4．5506，P&;lt;0．01)和GalT V-AS／SHG-44组(t=5．0865,P&;lt;0．001)。GalT V-AS／SHG-44组的死亡细胞加上凋亡细胞比例明显高于Mock组(t=3．2873，P&;lt;0．01)。高浓度的VP16(120μmoL／L)处理48h和72h后，GalT V-HA／SHG-44组死细胞所占比例明显低于Mock组(t=3．3664，P&;lt;0．05；t=5．4953，P&;lt;0．01)和GalT V-AS／SHG-44组(t=3．1732，P&;lt;0．01：t=4．6035，P&;lt;0．001)。②MTT分析显示，VP16处理48，72h后，GalT V-HA／SHG-44组活细胞数明显高于Mock组(t=5．0783,P&;lt;0．05；t=3．8923,P&;lt;0．01)和GalT V-AS／SHG44组(t=4．5667，P&;lt;0．01；t=4．7849，P&;lt;0．001)。③VP16(20μmoL／L)处理24h后，用Hoechst 33258染色。镜下观察到死亡或者凋亡细胞中的细胞核仁及断裂的核片段呈新月形。或核固缩并深染。GalT V-AS／SH组平均死亡和凋亡阳性率为41％，大大高于经同样处理的转染空载体和转染正义β-1，4-GaIT V的SHG44细胞。结论：β-1，4-GalT V能够影响抗肿瘤药VP16的杀伤作用，过表达β-1，4-GalT V可以拮抗VP16的作用，为解释胶质瘤的化疗耐药性提供了新的依据。     

小鼠膜型B7-H1分子激活同种异体Tr1细胞介导免疫抑制

目的:观察小鼠膜型B7-H1分子对同种异体CD4+T细胞分化和功能的影响,探讨B7-H1诱导免疫抑制的作用机制。方法:用经稳定转染而高表达膜型B7-H1分子的小鼠1B4.B6细胞刺激同种异体小鼠初始CD4+T细胞,检测被激活的CD4+T细胞的细胞因子分泌格局、免疫功能及Foxp3的表达。结果:与转染空载体的对照细胞相比,高表达B7-H1的1B4.B6细胞刺激同种异体CD4+T细胞产生高水平白细胞介素10(interleukin 10,IL-10)和干扰素γ(interferonγ,IFN-γ)、极低水平IL-4和IL-2。活化的CD4+T细胞具有免疫抑制活性,不表达Foxp3。结论:稳定转染B7-H1的1B4.B6细胞可通过其表面高表达的B7-H1分子诱导同种异体Ⅰ型调节性T细胞(type 1 regulatory T cells,Tr1)的分化。     

p38 MAPK信号通路在B7H1-Ig融合蛋白诱导Tr1细胞分化中的作用

目的 探讨丝裂原活化的蛋白激酶(MAPK)信号通路在B7Hl-Ig诱导Ⅰ型调节性T细胞(Tr1)分化过程中的作用.方法 以预包被而固相化的小鼠B7H1-Ig融合蛋白加抗CD3单克隆抗体(单抗)刺激新鲜分离的C57BL/6小鼠初始CD4+ CD62L+T细胞,诱导其向Tr1细胞分化.Western blotting检测MAPK信号通路(ERK1/2、p38 MAPK、JNK)的活化状况.在B7H1-Ig开始刺激时分别加入ERK1/2、p38和JNK通路特异性抑制剂PD98059、SB203580和SP600125,分别采用ELISA法、混合淋巴细胞反应(MLR)、流式细胞术和Western blotting分析检测抑制MAPK信号对B7H1-Ig刺激的CD4+T细胞产生的细胞因子分泌格局、功能及Foxp3表达的影响.结果 B7H1-Ig联合抗CD3单抗激活并诱导一群IL-10+ IFN-γ+IL-5+ IL-4low/-IL-2low/-Foxp3-Tr1细胞,通过分泌抑制性细胞因子IL-10发挥免疫抑制功能.Western blotting检测结果显示B7H1-Ig可激活CD4+T细胞中的p38 MAPK信号通路,对ERK1/2和JNK信号通路无明显影响.抑制p38 MAPK活性,可使B7H1-Ig诱导的CD4+T细胞IL-10和IL-5的分泌减少、免疫抑制功能减弱,促进B7H1-Ig刺激的CD4+T细胞向CD25+ Foxp3+调节性T细胞(Treg)分化.结论 p38 MAPK信号通路的活化或抑制是参与调控由B7H1-Ig诱导的Tr1细胞分化及其与CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg之间相互转化的重要分子机制.     

p27kip1及相关分子Jab1 CRM1在淋巴瘤细胞U937增殖过程中的表达变化及相互关系

目的探讨p27kip1及相关分子Jab1、CRM1在淋巴瘤细胞U937增殖过程中的表达及相互关系。方法采用血清饥饿合并释放处理淋巴瘤细胞株U937,通过细胞计数法检测该处理对U937细胞生长情况的影响;采用Western blot、免疫荧光双标法和激光共聚焦技术检测不同生长状态的U937细胞中p27kip1、Jab1的表达及亚细胞定位情况。结果血清饥饿造成U937细胞生长阻滞, p27kip1相关分子Jab1和CRM1表达下降,p27kip1蛋白总量增加,第10位丝氨酸磷酸化的p27kip1表达下降。与此同时,p27kip1也由胞浆高分布转变为胞核高分布。血清释放后上述分子呈现相反的变化,并且p27kip1的分布又主要集中在胞浆中。结论在刺激淋巴瘤细胞U937增殖过程中,Jab1和CRM1可能通过影响p27kip1的亚细胞定位与表达水平,参与调控淋巴瘤细胞的生长状态。     

CDK11P58和Cyclin D3在损伤后大鼠坐骨神经中的表达变化

为了探讨大鼠坐骨神经损伤对CDKll^p58和Cyclin D3表达的影响，本实验将成年SD大鼠随机分为假手术组和夹伤组，运用Western blot结合免疫荧光组织化学双标技术，观察了坐骨神经损伤后坐骨神经夹伤段、脊髓腰膨大前角和伤侧腓肠肌内CDKll^P58和Cyclin D3的表达变化。结果显示：（1）坐骨神经夹伤后，坐骨神经夹伤段及脊髓腰膨大前角、伤侧腓肠肌中的CDKll^58蛋白的表达先逐渐下降，后又逐渐上升；而Cyclin D3的表达无明显变化；（2）在假手术组的坐骨神经、脊髓腰嘭大前角和腓肠肌内都可观察到CDKll^P58和Cyclin D3的表达；而坐骨神经夹伤后，在上述部位可检测到CDKll^P58的表达强度明显减弱，但Cyclin D3无明显变化；（3）免疫荧光双标结果显示CDKll^P58和Cyclin D3在假手术组的坐骨神经、脊髓腰膨大前角和伤侧腓肠肌内都有共存；而在坐骨神经损伤后这种共存强度明显降低。以上结果提示，坐骨神经损伤可影响坐骨神经及脊髓腰膨大、伤侧腓肠肌内CDKll^P58的表达，但对Cyclin D3无明显影响，表明CDKll^P58可能在周围神经损伤和修复中发挥重要作用。     

β-1,4-半乳糖苷键在星形胶质细胞瘤中的表达特征

目的研究β-1,4-半乳糖苷键在各型人脑星形胶质细胞瘤中的表达变化特征。方法分别提取人正常脑及星形胶质细胞瘤蛋白质,通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）,考马斯亮蓝（CBB）染色。并利用特异识别β-1,4-半乳糖苷键的蓖麻凝集素-Ⅰ（RCA-Ⅰ）,经letin blot和组织化学方法分析β-1,4-半乳糖苷键在各型人脑星形胶质细胞瘤中的表达变化和表达定位。结果CBB染色结果显示,人正常脑及星形胶质细胞瘤的蛋白质组成相似。RCA-Ⅰ letin blot显示：星形胶质细胞瘤组织半乳糖基化较正常脑组织有升高趋势,并且有-61kD的蛋白在胶质瘤组织中被半乳糖基化。组织化学方法表明：β-1,4-半乳糖苷键散在表达于正常脑组织和各级胶质瘤组织中,随着肿瘤分级增高,表达β-1,4-半乳糖苷键的细胞增多：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ平均RCA-Ⅰ染色阳性率分别为15％、21％、28％和41％,而正常脑组织平均RCA-Ⅰ染色阳性率为8％。结论β-1,4-半乳糖苷键的表达与人脑星形胶质细胞瘤恶性程度密切相关,为分析β-1,4-半乳糖苷键及其相关糖基转移酶在恶性胶质瘤中的发病和诊治意义奠定基础。     

榄香烯乳对人胰腺癌移植瘤凋亡相关基因表达的影响

目的：探讨榄香烯乳对人胰腺癌移植瘤的抑制作用及其可能机制。方法构建人胰腺癌裸鼠移植瘤模型,随机分为阴性对照组（A组）、小剂量榄香烯乳组（B组）、大剂量榄香烯乳组（C组）、吉西他滨阳性对照组（D组）和联合用药组（E组）,每组6只。观察药物干预后肿瘤生长情况,采用实时荧光定量PCR方法检测凋亡相关基因PT EN、p53及Bcl‐2的表达情况。结果药物干预15 d后,B、C、D、E组肿瘤体积均较 A组减小（ P＜0．01）,肿瘤抑制率分别为46.58％、61.77％、74.9％、69.57％。与A组相比,E组PTEN和p53 mRNA表达升高（P＜0．05）,而Bcl‐2 mRNA表达稍有降低（P＞0．05）。结论榄香烯乳对人胰腺癌裸鼠移植瘤有明显抑制作用,可能与 PTEN和p53基因表达升高、Bcl‐2基因表达降低有关。     

β-1,4-半乳糖基转移酶V对胶质细胞瘤细胞SHG-44粘附的影响

目的：研究β-1，4-半乳糖基转移酶V(β-1，4-GalT V)对星形胶质瘤细胞株粘附能力的影响及其与细胞恶性行为的关系。方法：将转染正义、反义β-1，4-GalT V和空载体的SHG-44细胞株接种于包被有纤连蛋白(FN)或层连蛋白(LN)的板上，观察细胞粘附力的变化：采用Western Blot的方法检测整合蛋白β1表达变化及局部粘着斑激酶(FAK)的蛋白水平和FAK的酪氨酸磷酸化水平：结果：在FN和LN包被的板上，与转空载体的SHG-44细胞株相比，转正义β-1，4-GalT V比转反义β-1，4-GalT V的细胞在纤连蛋白和层连蛋白上的粘附能力增高，B1蛋白表达水平升高，FAK及其酪氨酸磷酸化水平增强。结论：β-1，4-GalT V对SHG-44细胞的粘附能力确有影响，提示β-1，4-GalT V的表达可能与胶质瘤的侵袭性有关。     

N-糖链合成相关β-1,4半乳糖基转移酶在人星形胶质细胞瘤中的表达

目的分析与N-糖链合成相关β-1,4半乳糖基转移酶-Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ(β1,4-galactosyltransferaseⅠ、Ⅱ、Ⅴ,β-1,4-GalT-Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ)mRNA在正常脑组织和各级人星形胶质细胞瘤的表达变化。方法采用RT-PCR方法,分析β-1,4-GalT-Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ在人星形胶质细胞瘤的表达存在。以扩增的3种同工酶cDNA片段作为探针进行标记,Northernblot分析其mRNA在正常脑组织和各级人星形胶质细胞瘤中的表达变化。结果RT-PCR检测到β-1,4-GalT-Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ在人星形胶质细胞瘤中的表达存在。northernblot发现β-1,4-GalT-Ⅱ、Ⅴ在正常脑组织中有表达,但β-1,4-GalT-Ⅱ的表达较低,而β-1,4-GalT-Ⅰ在正常脑组织中表达极低。β-1,4-GalT-Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ在星形胶质细胞瘤中的表达显著高于正常脑组织。其中,β-1,4-GalT-Ⅰ、Ⅱ在各级胶质瘤中的表达没有明显差异。而β-1,4-GalT-Ⅴ的表达随胶质瘤分级的增高而增加。结论N-糖链合成相关的β-1,4-GalT-Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ在人脑星形胶质细胞瘤发生过程中的表达不同,尤其是β-1,4-GalT-Ⅴ的表达与人星型胶质瘤的恶性程度显著相关。