NF-κB的信号通路与阻断策略

核因子κB(nuclearfactor -kappaB ,NF -κB)是普遍存在于细胞浆中以p5 0 /p6 5异二聚体为形式的一种快反应转录因子 ,与NF -κB的抑制性蛋白 (in hibitorkappaB ,IκB)结合而呈非活性状态。大量研究表明 ,它可以被多种刺激剂 ,如TNF -α、IL - 1、神经生长因子、蛋白激酶C激活剂、有丝分裂原、氧化剂、细菌、病毒、免疫刺激剂、脂多糖 (lipopolysacchar ide ,LPS)、自由基以及紫外线等激活[1- 3] 。激活的NF -κB与IκB解离后转位入核与靶基因启动子 /增强子上的κB位点结合 ,从而调节许多靶基因的表达 ,因此被誉为控制早期基因…     

c-Jun氨基末端激酶在小鼠T细胞增殖中的作用

目的研究c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)在小鼠T细胞增殖中的作用。方法以活体染料羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)染色,建立了在多克隆刺激剂刀豆蛋白A(Con A)刺激下评价小鼠T细胞增殖的模型,通过流式细胞术分析JNK的一种新的特异性抑制剂SP600125在不同剂量、不同时间对T细胞增殖的影响,并应用CellQuest软件分析增殖细胞各代所占比例和增殖指数(PI)及抑制指数(HI)。采用碘化丙锭染色分析不同剂量SP600125对Con A或佛波醇酯(PDB)加离子霉素(Ion)刺激的小鼠T细胞周期变化的作用。结果随着SP600125浓度从1.0μmol/L逐渐增至16.0μmol/L,Con A对T细胞的促增殖作用逐渐减弱,以8.0～16.0μmol/L的抑制作用最为明显,呈剂最依赖关系(r=0.98,P<0.01);选择最佳剂量8.0μmol/L,SP600125对T细胞增殖的抑制作用随时间从24h递增至96b而逐渐增强;进一步发现SP600125能使PDB加Ion刺激的小鼠T细胞停滞于G_0/G_1期,阻止其进入S期和G_2/M期,且阻止作用随上述浓度的增加而增强,呈明显剂量依赖关系(S期:r=-0.98,P<0.01;G_2/M期:r=-0.88,P<0.05);SP600125也呈剂量依赖性地使Con A诱导的T细胞停滞于G_0/G_1期,阻止其进入S期(r=-0.90,P<0.05)。结论JNK信号通路的活化在小鼠T细胞增殖中可能起着重要作用。     

紫外线对角质细胞线粒体功能及凋亡的影响研究

目的： 分析紫外线（UV）照射对HaCaT角质细胞系线粒体功能及凋亡的影响。 方法： 以紫外线低剂量（UVA2J/cm2，UVB10mJ/cm2）和高剂量（UVA6J/cm2，UVB30mJ/cm2）照射HaCaT细胞，继续培养15 h，用流式细胞仪检测线粒体膜电位（△ψm）、线粒体质量（mitochondrial mass）；使用碘化丙啶（PI）进行DNA染色并用流式细胞仪检测亚二倍体分析凋亡，以及进行Annexin V-FITC与PI共染色，用激光共聚焦显微镜观察细胞凋亡情况。 结果： HaCaT细胞经紫外线照射后，△ψm下降的细胞比例随着照射剂量的增加而增加，对照组、低剂量组及高剂量组分别为7.94%±1.02%、25.87%±4.55%、39.27%±5.32%；线粒体质量降低的细胞比例同样随着照射剂量的增加而增加，对照组、低剂量组以及高剂量组分别为15.19%±1.58%、40.36%±4.41%、68.79%±5.46%。用PI检测DNA含量所产生的亚二倍体峰观测凋亡率，对照组、低剂量组以及高剂量组凋亡率分别为1.82%±0.51%、30.16%±5.47%、58.49%±5.98%。用Annexin V-FITC/PI染色分析细胞凋亡程度，其结果与PI-DNA染色所得结果一致，对照组仅有少量细胞死亡，低剂量组凋亡细胞较对照组为多（Annexin V-FITC单阳性细胞），高剂量组以坏死细胞为多（Annexin V-FITC/PI双阳性）。 结论： HaCaT细胞经紫外照射后，线粒体去极化作用增强，同时线粒体质量降低，这些变化与细胞凋亡相关。     

CpG ODN促进树突状细胞成熟的实验研究

目的：研究CpG ODN对小鼠骨髓来源的树突状细胞(bone marrow—derived dendritic cells,BMDC)分化成熟的影响。方法：以含非甲基化CpG基序的寡核苷酸(unmethylated CpG motif containing oligonucleotides,CpG ODN)刺激BMDC，流式细胞术检测DC膜表面CD80表达，ELISA检测DC分泌IL-l2水平，MTT法测定CpG ODN活化的DC刺激T细胞培殖能力。结果：CpG ODN可显著刺激DC表达CD80，分泌IL-l2，增强DC刺激T细胞增殖的能力。结论：CpG ODN可以有效促进DC的功能成熟。     

地塞米松影响小鼠胸腺细胞线粒体膜电势变化研究

目的：研究地塞米松刺激小鼠胸腺细胞过程中线粒体膜电势（△Ψm）的变化。 方法： 以终浓度1×10－6mol/L地塞米松（DEX）刺激小鼠胸腺细胞，通过JC-1染色流式细胞术，在0、1、3、5、7、9、11、24和27 h时点分别检测小鼠胸腺细胞平均J-aggregate（FL2）和平均J-monomer （FL1）含量，并计算线粒体膜电势（FL2/FL1）。 结果： 本研究中，小鼠胸腺细胞离体后FL1所反映的线粒体质量迅速下降，至5 h对照组达到平台期（913.38±70.11），然后缓慢下降到27 h的（622.80±22.81）。DEX组FL1在1 h和3 h与对照组没有显著差异（P>0.05），而从5 h（660.91±72.95）开始显著低于对照组（P<0.01），并且随培养时间延长呈下降趋势，至27 h的（309.70±53.35）。对照组和DEX组FL2随培养时间延长而降低。1-9 h，对照组和DEX的△Ψm没有显著差异（P>0.05）。而在11、24和27 h，对照组△Ψm分别为（256.41±21.59）、（214.14±23.21）和（146.14±17.97），而DEX组△Ψm显著低于对照组（P<0.01），分别为（138.28±20.59）、（111.61±29.67）和（72.92±17.86）。 结论： DEX诱导小鼠胸腺细胞凋亡过程中，线粒体质量降低和△Ψm下降是早期事件，而细胞内现存线粒体△Ψm下降则是较晚期的事件。在本研究中，线粒体质量下降与现存线粒体膜电势的变化之间关系不紧密。     

ERK信号途径对EGF诱导的HaCaT细胞增殖具有双向调节作用

目的利用带有ERK-2基因的腺病毒载体感染成角质细胞系HaCaT,探讨ERK信号途径在EGF对HaCaT细胞增殖影响中的作用。方法用3H-TdR掺入法检测HaCaT细胞增殖及PD98059对EGF促HaCaT细胞增殖的影响。腺病毒载体转染HaCaT细胞,流式细胞仪检测转染率,W estern b lot检测ERK-2蛋白的表达。结果1μg/L和10μg/L EGF可促进HaCaT细胞增殖,而100μg/L EGF促增殖作用反下降。PD98059抑制EGF引起的HaCaT细胞增殖,且具有浓度依赖性。腺病毒载体具有高转染率,感染Ad-ERK2的HaCaT细胞高表达ERK-2。EGF抑制转染的HaCaT细胞增殖。结论ERK信号途径在EGF促HaCaT细胞增殖中具有双向调节作用。     

ERK1／2信号通路对T淋巴细胞的影响

细胞外信号调节激酶1／2（extracellular regulated kinase1／2，ERK1／2）是将信号从细胞表面受体传导至细胞核的关键。磷酸化的ERKl／2由胞质转位到核内，进而介导NF-AT、AP-1、NF-KB等转录因子的活化，参与细胞多种生物学反应。近年来研究发现，ERK1／2信号通路的激活能促进T淋巴细胞的活化、增殖并抑制其凋亡，这可能为T淋巴细胞相关的免疫性疾病和肿瘤的治疗提供了新的策略。     

Jagged-1在肿瘤新生血管形成中的双重作用

Jagged-1是存在于哺乳动物细胞膜上Notch受体的主要配体之一,在许多组织的生长发育中起着重要作用。研究表明Jagged-1-Notch信号参与肿瘤新生血管化,表现为诱导血管特异性酶活化促进内皮细胞分化,导致内皮-间质细胞移行促进血管发育;上调内皮细胞标志分子如血管内皮钙黏附蛋白、血小板内皮细胞黏附分子-1、血管生成素受体-2、纤维连接蛋白、血小板源生长因子受体和α-平滑肌肌动蛋白等的表达,促进内皮和平滑肌细胞分化;与TGF-α和EGF等生长因子激活的通路共同作用促进血管样结构的形成。但也发现Jagged-1-Notch信号通路下游的HERP1通过阻止myocardin而抑制血管平滑肌细胞标志蛋白SM-MHC和平滑肌22-α的表达,同时通过干扰血清应答因子与SM-MHC中含CArG的启动子结合而抑制血管平滑肌细胞的分化;Jagged-1信号通过p21Cip1抑制cyclinD和cdk4的核定位以及Rb蛋白的磷酸化,从而抑制血管内皮细胞的增殖。Jagged-1所呈现的反向双重作用机制仍有待阐明。     

金黄色葡萄球菌肠毒素B对小鼠树突状细胞表面I-Eκ分子表达的影响

目的　探讨金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)对小鼠树突状细胞 (DC)表面I-Eκ 分子表达的影响。方法　密度梯度离心获得小鼠脾单个核细胞 ,Panning法纯化非贴壁细胞得到DC ;免疫组化SABC法检测DC纯度 ;流式细胞术检测SEB刺激后DC表面I -Eκ 分子的表达。结果　DC纯度为 70 %～ 80 %。I -Eκ 的表达在 10 0ng/mlSEB刺激 8h后达到高峰。结论　SEB可显著提高DC表面I -Eκ 分子的表达 ,该刺激作用有一最佳量效和时效关系。     

腺病毒介导细胞外信号调节激酶2表达对去分化软骨细胞增殖及胞外基质合成的影响

目的:观察腺病毒介导细胞外信号调节激酶2的过度表达对去分化软骨细胞增殖和细胞外基质合成的影响,以及腺病毒介导细胞外信号调节激酶2用于修饰去分化软骨细胞的可行性。方法:实验于2004-09/2005-05在暨南大学组织移植与免疫研究中心进行。SD大鼠5只,周龄为3～5周,此处请核对体质量为(150±20)g,分离、培养大鼠肋生长板软骨细胞,利用Adeasy系统构建携带细胞外信号调节激酶2基因的腺病毒载体。流式细胞仪检测不同感染复数的携带细胞外信号调节激酶2基因的腺病毒载体感染第5代大鼠肋生长板软骨细胞的效率,Westernblot检测携带细胞外信号调节激酶2基因的腺病毒载体感染大鼠肋生长板软骨细胞中细胞外信号调节激酶1/2和磷酸化细胞外信号调节激酶2的表达,3H-TdR,3H-proline和35S-sulfate同位素掺入检测携带细胞外信号调节激酶2基因的腺病毒载体感染对大鼠肋生长板软骨细胞增殖、胶原和蛋白多糖合成的影响。结果:①成功构建携带细胞外信号调节激酶2基因的腺病毒载体重组腺病毒。②100感染复数的携带细胞外信号调节激酶2基因的腺病毒载体感染第5代大鼠肋生长板软骨细胞的效率大于90%。③携带细胞外信号调节激酶2基因的腺病毒载体感染的第5代大鼠肋生长板软骨细胞中细胞外信号调节激酶1/2和磷酸化细胞外信号调节激酶2的表达均显著增加,分别是Ad-CMV组的15.58和1.85倍。④同位素检测结果表明携带细胞外信号调节激酶2基因的腺病毒载体的感染促进3H-TdR、3H-proline和35S-sulfate的掺入,分别是对照组的2.52,1.61和1.53倍(P<0.05)。结论:腺病毒介导细胞外信号调节激酶2基因的过度表达促进去分化大鼠肋生长板软骨细胞的增殖和细胞外基质成分的合成。