肝癌干细胞抗体靶向治疗的实验

目的研究抗人肝癌干细胞鼠单抗15B7的生物学特征、体内外功能,探讨靶向肝癌干细胞是否能够有效抑制肝癌移植瘤复发、自发性肺转移以及延长荷瘤小鼠的生存期。方法采用双色免疫荧光、双色流式细胞技术、皮下成瘤实验,检测、鉴定15B7单克隆抗体能够识别肝癌干细胞(hepatocellular carcinomacancer stem cells, HCC-CSC)。从人肝癌细胞系BEL7402中以流式细胞仪分选具有CD133+或ESA+表型的细胞。在此基础上采用CCK-8细胞增殖实验、侵袭实验、迁移实验等检测分析15B7单抗对CD133+表型的细胞增殖、侵袭、迁移的作用以及对细胞周期的影响。裸鼠体内治疗实验研究15B7单抗对BEL7402移植瘤生长的抑制作用。以Western blot方法鉴定该功能性单抗的抗原。结果双色免疫荧光和双色流式检测显示15B7单抗能与HCC-CSC的标志物ESA、CD133共染;流式分选15B7+或ESA+或CD133+的细胞在体外无血清培养条件下有良好的成球生长能力;流式分选的15B7+细胞裸鼠皮下接种1×104个/只,2月可形成肿瘤,以上实验证明15B7单抗是抗肝癌干细胞的单抗。体外功能实验结果显示15B7单抗能够抑制CD133+细胞的增殖、迁移、侵袭,抑制率分别达13.8%、157%和30.9%,同时还能诱导CD133+细胞发生G1期阻滞。体内治疗实验研究结果表明15B7单抗能明显抑制裸鼠肝癌移植瘤生长,抑制率可达60.5%。Western blot显示15B7单抗识别HCC-CSC表达的抗原蛋白相对分子质量约50 kD。结论15B7单抗能明显抑制裸鼠体内人肝移植瘤的生长,为肝癌干细胞的靶向治疗提供有重要应用价值的候选抗体药物。     

胃癌干细胞单克隆抗体联合顺铂靶向治疗胃癌的实验研究

目的:探讨靶向胃癌干细胞单克隆抗体的生物学特征及其联合顺铂治疗胃癌的疗效.方法:采用无血清悬浮培养法和PKH26染色法确定胃癌SNU-5细胞中存在肿瘤干细胞.细胞免疫荧光法检测单克隆抗体21A3识别的抗原蛋白与PKH26+细胞及特异性抗原(CD90)在SNU-5细胞中的表达情况.无血清悬浮培养法检测流式细胞术分选出的21A3+细胞的自我更新能力以及21A3对SNU-5细胞自我更新能力的影响.CCK8法检测21A3对细胞顺铂耐药能力的影响.裸鼠体内治疗实验分析21A3联合顺铂对SNU-5移植瘤生长的抑制作用.结果:SNU-5细胞无血清悬浮培养11d后形成的细胞球体中存在单个PKH26+细胞.细胞免疫荧光显示,单克隆抗体21A3识别的抗原分子能与PKH26和CD90在SNU-5细胞上共定位.21A3+细胞体外成球率高于21A3-细胞.21A3+细胞具有更高的耐药性,21A3+细胞和21A3-细胞的IC 50分别为0.104μmol/L和0.025μmol/L.单克隆抗体21A3能够显著抑制SNU-5细胞的无血清成球,抑制率为37.5%.经21A3处理后的SNU-5细胞,耐药能力下降,其IC 50为0.001μg/ml,而对照组的IC 50为0.003μg/ml.抗体体内治疗实验结果显示,10、5、2.5mg/kg的21 A3组的肿瘤生长抑制率分别为80.6%、69.6%和59.2%,10mg/kg 21A3+顺铂组的肿瘤生长抑制率为90.6%,顺铂组的肿瘤生长抑制率为55.8%.结论:单克隆抗体21A3是抗胃癌干细胞的功能性单克隆抗体.     

入 IL-2转基因表达及对小鼠黑色素瘤生长的影响

临床应用重组IL-2联合LAK或TIL细胞治疗黑色素瘤、肾细胞癌等恶性肿瘤虽有一定疗效,但毒副作用较大。若将IL-2基因转入到某种基因运载细胞中稳定表达后输入体内,通过其在肿瘤局部持续分泌一定量的IL-2激活机体抗肿瘤免疫反应,则有可能避免输入大量IL-2引起的毒副作用。本实验用逆转录病毒载体介导转移人IL-2基因在小鼠黑色素瘤细胞中稳定表达,并观察其体内的抗肿瘤作用。将人IL-2cDNA插入连接到逆转录病毒载体上,所构建的重组病毒载体经序列分析表明,所插入的人IL-2cDNA全长774bp。用磷酸钙法将重组病毒载体转染病毒包装细胞PA317,经G418抗性选择,获得滴度     

抗HSP90抗体通过内化eHSP90抑制人胃癌干细胞并提高顺铂的抗癌效果

目的：探索抗HSP90单克隆抗体28C10通过靶向肿瘤干细胞促进顺铂(cisplatin,DDP)对人胃癌细胞PAMC82恶性生物学行为的抑制效果及其可能的作用机制。方法:28C10单独或与DDP联合处理人胃癌细胞PAMC82,采用不同实验方法检测该细胞的无血清成球能力、迁移和侵袭能力与克隆形成能力,CCK-8法检测28C10对PAMC82细胞恶性生物学行为和协同DDP抗癌能力的影响。采用细胞免疫荧光及流式细胞术检测PAMC82细胞中HSP90及eHSP90(extracellular HSP90)的表达、定位、eHSP90⁺亚群比例,以及28C10处理后对ALDH⁺、CD44⁺、eHSP90⁺细胞亚群的影响。采用WB实验检测28C10作用后PAMC82细胞中HSP90、干性相关蛋白以及PI3K/AKT/mTOR信号通路蛋白表达的变化。结果：胃癌细胞PAMC82膜表面表达eHSP90,具有2%～3%的eHSP90⁺细胞亚群,且eHSP90⁺细胞多为与ALD...