肺癌抑制性抗体及其抗原的鉴定

目的：鉴定抑制肺癌细胞生长的功能性单克隆抗体1E2及其抗原，为治疗肺癌提供有潜力的靶向抗体治疗剂和分子靶位。方法：采用活细胞荧光、MTT细胞增殖实验、ELISA、动物体内治疗实验等方法检测鼠单克隆抗体1E2对人肺癌细胞增殖的抑制、单抗与癌细胞的结合部位、单抗的亚类和单抗对肺癌移植瘤的抑制，以Western blotting和MALDITOF质谱方法鉴定该功能性单抗的抗原。结果：单抗1E2能够与肺癌细胞GLC82和NCI-H520的细胞膜结合，在体外能够明显抑制肺癌细胞的增殖。动物实验表明单抗1E2能够抑制肺癌移植瘤的生长，抑制率达49％。Western blotting显示其抗原相对分子质量约110000，质谱鉴定该抗原为氨甲酰磷酸合成酶（carbamoyl-phosphate synthetase1，CPS1）。结论：单抗1E2能够在体内外抑制肺癌的生长，具有成为肺癌靶向治疗剂的潜力。该抗体识别的抗原CPS1可表达于肺癌细胞的细胞膜，可能是一个肺癌靶向治疗的新靶位。     

抑制结肠癌细胞与肝窦内皮细胞黏附的功能性抗体的初步研究

目的:研制抑制结肠癌细胞与肝窦血管内皮细胞黏附的功能性单抗,鉴定该单抗识别的抗原分子.方法:以人肝窦内皮细胞(human liver sinusoidal endothelial cell, HLSEC)免疫BALB/c小鼠,将小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,采用甲基纤维素选择培养液培养,制备抗HLSEC的单克隆抗体库.采用免疫荧光染色、黏附实验等方法筛选、鉴定能抑制结肠癌Ls174T细胞与肝窦内皮细胞黏附的功能性单克隆抗体.提取肝窦内皮细胞膜蛋白,采用Western blotting方法鉴定单抗识别的功能性抗原蛋白.结果:HLSEC免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合后产生1 440个杂交瘤株,获得119株产生抗HLSEC抗体的阳性克隆,其中20株能显著抑制具有肝转移能力的结肠癌Ls174T细胞与HLSEC的黏附;其中15株为IgM型,3株为IgG型,2株测不到重链;其中1株抗黏附能力最强的单抗(黏附抑制率为51%)命名为12B6,该单抗在5～200 μg/ml范围内显著阻断HLSEC与Ls174T的黏附,且呈剂量依赖性;单抗12B6所识别的HLSEC抗原蛋白的相对分子质量为46 000.结论:建立了抗HLSEC单克隆抗体库,获得了20株具有抑制结肠癌细胞与肝窦血管内皮细胞黏附的功能性抗体,初步鉴定了一种可能参与结肠癌肝转移的黏附分子,为结肠癌的组织器官特异转移机制及靶向治疗的研究奠定了一定的基础.     

抗人血管内皮生长因子嵌合抗体在真核细胞中的高效表达

目的：在中国仓鼠卵巢（Chinese hamster ovary,CHO)细胞中高效表达有活性的抗人血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF)嵌合抗体,并探索获得最佳表达的途径。方法：采用一种新型的基因工程抗体真核高效表达载体系统,将抗VEGF嵌合抗体轻,将抗VEGF嵌合抗体轻、重链基因导入二氢叶酸还原酶缺陷型CHO细胞,筛选表达抗VEGF嵌合抗体的克隆,再进行递增逍度的氨甲喋呤（methotrexate,MTX)加压扩增表达,采用ELISA检测所表达的嵌合抗体的生物学特性和产量。结果：采用三种不同的筛选加压扩增表达方法获得的结果有差异,其中采用每轮加压扩增表达后进行亚克隆的方法获得了高表达产量的克隆,产量可达28ug/ml。ELISA结果证实所表达的抗体为特异地与VEGF结合的、含人抗体恒定区的抗VEGF嵌合抗体。结论：成功地在真核细胞中高效表达了有活性的抗VEGF嵌合抗体,为下一步该嵌合抗体的临床试用奠定了重要的基础。并探索出该表达系统最佳的筛选加压扩增表达方法。     

羧肽酶A4活化STAT3促进肝癌细胞增殖、迁移和侵袭

目的 探究肿瘤相关基因羧肽酶A4(CPA4)对肝癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及其相关分子机制.方法 慢病毒载体构建MHCC97L-CPA4过表达细胞系和MHCC97H-shCPA4敲减细胞系,分别以MHCC97L-vector和MHCC97H-shNC细胞系作为对照.采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和weste...     

高转移胃癌细胞株的建立及其肿瘤干细胞的生物学特征

目的:建立高转移胃癌细胞株并研究其肿瘤干细胞生物学特征.方法:将胃癌细胞株SNU-5接种至裸鼠皮下成瘤后,取肺部转移灶,通过机械分离法并反复接种裸鼠,获取细胞株SNU-5-V12,采用无血清悬浮培养及PKH26染色确定SNU-5-V12细胞中存在肿瘤干细胞.流式细胞术分析SNU-5和SNU-5-V12细胞中CD44肿瘤干细胞标志物表达情况,分选SNU-5和SNU-5-V12细胞中CD44+细胞并进行体外生物学特征研究及裸鼠致瘤实验.结果:建立高转移SNU-5-V12细胞株,SNU-5-V12细胞无血清悬浮培养11d后形成的细胞球体中存在单个PKH26阳性细胞.流式分析显示高转移SNU-5-V12细胞中干细胞标志物CD44比例显著高于SNU-5细胞[(72.9±1.5)％ vs (8.96±1.2)％],且SNU-5-V12的CD44+细胞比SNU-5的CD44+细胞具有更强的自我更新能力[成球率(27.8±1.7)％ vs (20.4±1.0)％,P＜0.01],转移细胞数增加1.64倍[(329.5±7.5) vs (200±2.0)个,P＜0.01],耐药能力也显著增强[IC50:(0.286 vs 0.196)μ∥ml,P＜0.01],裸鼠皮下接种2×102个CD44+ SNU-5-V12细胞2个月2/6裸鼠可致瘤,而CD44+ SNU-5细胞需要接种2×104个细胞2个月时仅1/6裸鼠致瘤.结论:获得高转移胃癌细胞株SNU-5-V12,其CD44+细胞体内外功能显著增强,为胃癌干细胞的靶向治疗提供有价值的细胞模型.     

功能差异细胞模型筛选抗肺癌功能性单克隆抗体及其抗原

目的:筛选获取抗肺癌细胞膜的功能性单克隆抗体及其靶抗原，为肺癌靶向治疗提供候选治疗剂及靶标。方法: 将新鲜人肺癌组织细胞免疫BALB/c小鼠,采用脾细胞融合法制备大容量单克隆抗体库。建立肺癌细胞增殖、侵袭、迁移等定向功能差异细胞模型，采用活细胞免疫荧光与功能差异模型筛选其抗原在定向功能（细胞增殖、迁移、侵袭）差异模型细胞膜上差异表达的单抗，再经体外相应功能实验筛选具有抑制作用的功能性单抗，Western blotting鉴定这些单抗的抗原，裸鼠体内抑瘤实验鉴定部分单抗对肺癌的抑制作用。结果: 细胞融合后共获得2 893株杂交瘤克隆，其中与肺癌细胞膜结合反应的309株。分别建立了3种体外肺癌细胞增殖、侵袭、迁移差异模型用于筛选，筛选获得20株单抗能显著抑制肺癌细胞增殖、10株单抗能显著抑制肺癌细胞侵袭、5株单抗能显著抑制肺癌细胞迁移（P<0.05或P<0.01）。Western blotting鉴定了其中6株的抗原。选取其中2株单抗均能在裸鼠体内显著抑制肺癌移植瘤的生长（P<0.05或P<0.01）。结论: 采用大容量功能性单抗库技术结合功能差异细胞模型可批量筛选获得具有体内外抑制肺癌细胞恶性生物学行为的功能性单抗，为筛选肺癌靶向治疗剂及靶标提供了一种潜在的新方法。     

单克隆抗体12H6的靶抗原在肺癌细胞中的表达及功能研究

[目的]分析抗肺癌单抗12H6的靶抗原在肺癌细胞系和肺癌组织中的表达,研究单抗12H6体内外生物学功能.[方法]细胞免疫荧光、流式细胞荧光法检测单抗12H6靶抗原在3种肺癌细胞系中的表达及其定位,免疫组化法检测其在人肺癌组织中表达及特异性;Transwell法和CCK-8法分别检测12H6体外对肺癌细胞系侵袭和增殖功能的影响.共接种模型裸鼠体内治疗实验研究12H6对移植瘤生长的抑制作用.[结果]单抗12H6的靶抗原在人肺腺癌细胞(A549、GLC-82)、人肺鳞癌细胞(GLC-P)的胞内及胞膜均有表达,在3种细胞系胞膜的表达比例分别为31.2％、15.4％和16.7％.单抗12H6在人肺癌组织中的表达比例为80.6％,较配对癌旁组织显著上调.单抗12H6在体外能明显抑制肺癌细胞侵袭和增殖;体内能明显抑制移植瘤生长,抑制率为40％.[结论]单抗12H6具有优良的体内外抑瘤功能,可能为肺癌靶向治疗提供潜在的靶向治疗药物.     

抗肝癌干细胞功能性单克隆抗体的研制

摘 要? 目的：研制抗肝癌干细胞的功能性单克隆抗体,为肝癌干细胞的靶向治疗提供候选抗体药物。方法：从人肝癌组织中分离人肝癌干细胞样细胞（human liver cancer stem-like cells, hLCSLCs）,免疫BALB/c裸鼠,采用脾细胞融合法制备大容量单抗库。应用细胞免疫荧光、无血清成球培养、裸鼠皮下成瘤等方法筛选、鉴定特异识别肝癌干细胞的单克隆抗体。流式细胞仪分选hLCSLCs侧群细胞（hLCSLCs side population cells, hLCSLCs-SP）,无血清悬浮培养法和CCK-8法检测杂交瘤单抗对hLCSLC-SP自我更新和增殖能力的影响。结果：细胞融合后获得2 964株杂交瘤克隆,在能与hLCSLCs反应的237株克隆中,有116株单抗能与hLCSLCs的细胞膜结合,其中的33株杂交瘤单抗只与hLCSLC-SP反应（阳性率为2%~5%）、不与非hLCSLC-SP反应。该33株单抗中有6株能与CD133阳性细胞有不同比例的共染,并且与无血清悬浮培养的成球细胞呈阳性反应(阳性率为3%~26%),明显高于hLCSLCs-SP。裸鼠皮下接种1×104个15D2单抗阳性的hLCSLCs,成瘤率为100%。功能性筛选实验发现,6株单抗中的4株能显著抑制hLCSLC-SP的增殖和成球生长,其抑制率分别为24%~42%和13%~50%。结论：采用自建的大容量单克隆抗体库技术,筛选获得了4株特异性识别hLCSLC-SP的功能性单抗,为肝癌干细胞的抗体靶向治疗奠定了基础。     

抗CEA嵌合抗体在CHO细胞中的高效表达

目的 为了在ＣＨＯ－ｄｈｆｒ细胞中高效表达有活性的抗入ＣＥＡ鼠－人嵌合抗体。方法构建抗ＣＥＡ嵌合抗体的真核高效表达载体,转染ＣＨＯ－ｄｈｆｒ细胞,通过加入ＭＴＸ进行基因扩增表达,获得高产细胞株。采用Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｏｌｔ、ＥＬＩＳＡ、体内放射免疫实验等方法鉴定所表达的嵌合抗体的生物学特征。结果 获得产量可达６０μｇ／ｍｌ的细胞株。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ、ＥＬＩＳＡ、体内放射免疫实验证明所表达的     

99mTc标记的抗CEA小分子嵌合抗体的体内分布与肿瘤显像

[目的]采用99mTc标记抗人CEA小分子嵌合抗体Rch24 F(ab')2,研究其在荷人结肠癌裸鼠体内的生物学分布及放射免疫显像的特征与应用价值.[方法]采用SnC12直接还原法标记抗体,快速薄层层析法(ITLC)测定抗体的标记效率、放化纯度和体外稳定性,ELISA检测标记抗体的免疫比活性.荷人结肠癌裸鼠尾静脉注射99mTc-Rch24 F(ab')2后,研究标记抗体在裸鼠体内的生物学分布,并进行肿瘤显像.[结果] 99mTc-Rch24 F(ab')2的标记率为90％,放化纯度＞95％.99mTc-Rch24 F(ab')2的放射比活为840MBq/mg,免疫比活性为65.7％.标记抗体24h时放射性脱落小于5％.荷瘤裸鼠注射99mTc-Rch24 F(ab')2 3h后即可观察到肿瘤影像,5～24h均可获得清晰的肿瘤影像,标记抗体在体内呈肿瘤靶向性分布,12h时肿瘤的摄取和多数脏器T/NT比值均达到最高水平.[结论]99mTc-Rch24 F(ab')2在体内靶向分布于结肠癌肿瘤组织,具有较高的T/NT比值并可在肿瘤局部滞留,注射99mTc-Rch24 F(ab')25h后肿瘤成像满意.99mTc-Rch24 F(ab')2在临床肿瘤的放射免疫分子显像诊断中具有良好的应用前景.