用Cre-Loxp系统构建人胶质瘤单链抗体噬菌体抗体库

目的　构建人源性胶质瘤噬菌体抗体库 .方法　从胶质瘤患者外周血淋巴细胞中提取细胞总 RNA,经逆转录后用套式 PCR分别扩增抗体轻链 Vκ 和重链 VH 基因 .分别构建 Vκ5 .5× 10 6,VH3.5× 10 6基因库 ,连接 Vκ和 VH构建单链抗体 (Sc Fv)基因库 ,并克隆入表达载体 p DNA5内进行重组 ,得到 Sc Fv噬菌体抗体库 .结果　表明经 Cre- L oxp5 11系统重组后 ,噬菌体抗体库库容量达到 6 .0× 10 8,测序证实抗体基因与人源性抗体基因数据库同源 .结论　利用 Cre- L oxp5 11胞内重组系统成功地构建了较大容量的人源性脑胶质瘤噬菌体抗体库 ,为进一步筛选特异性人源性胶质瘤 Sc Fv奠定了基础 .     

肝细胞肝癌中血管内皮生长因子及其受体表达的意义及p53,ras的调控作用

目的　探讨血管内皮生长因子(VEGF)及其受体KDR在肝细胞肝癌(HCC)的血管生成、生长及转移中的作用及p53,ras对VEGF表达的调控.方法　用免疫组织化学、原位杂交及图像分析的方法研究肝细胞肝癌45例,肝硬化21例及正常肝8例的石蜡标本切片,从而探讨VEGF,KDR与肝癌病理学特点的关系及p53,ras对其表达的影响.结果　肝癌组中VEGF的表达明显高于肝硬化组和正常肝组,3组的表达率分别为64%(29/45),14%(3/21),12%(1/8).VEGF的表达与肝细胞肝癌的血管生成和转移显著相关(r=0.4607,P<0.05),p53可上调VEGF的表达(P<0.05),而ras对其无影响(…     

肝细胞肝癌中血管内皮生长因子及nm23-H1蛋白的表达

目的 探讨肝细胞肝癌中与肿瘤转移相关的血管内皮生长因子（ｖａｓｕｃｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ,ＶＥＧＦ）,ｎｍ２３－Ｈ１表达上的关系。方法 用免疫组化及图像分析的方法研究了４５例肝癌石蜡标本切片的ＶＥＧＦ,ｎｍ２３－Ｈ１的表达,进而探讨了ＶＥＧＦ的表达与ｎｍ２３－Ｈ１之间的关系。结果 ＶＥＧＦ及ｎｍ２３－Ｈ１与肝癌的转移均显相关,而二之间无相关性。结论 ＶＥＧＦ     

SARS病毒N蛋白特异性单链抗体的筛选

目的 利用大容量人源性SARS单链抗体库筛选N蛋白的特异性单链抗体。方法利用RT-PCR的方法克隆了SARS病毒的N蛋白基因，克隆入原核表达载体pBV220，在大肠杆菌DH5a中进行表达并经离子交换色谱纯化后得到了纯度达95％以上的N蛋白，然后以此蛋白包被25cm^2组织培养瓶，对SARS单链抗体库进行先松弛，后严谨的筛选、富集，进行4轮筛选后对所筛的抗体进行ELISA鉴定。结果经过4轮的筛选、富集，得到了1株高亲和力的N蛋白单链抗体N18。结论在对SAILS疾病的早期检测或筛查、SARS病毒的生活周期及发病机理的研究中N18将起到重要的作用。     

抗人SARS病毒单链抗体库的构建

目的:利用细胞内重组的方法,构建大库容量的人源性抗SARS病毒单链抗体(scFv)库,为筛选SARS病毒抗原的人源性抗体奠定基础。方法:取6例SARS康复患者的80mL外周血,分离淋巴细胞后提取总RNA。分离纯化mRNA并反转录成cDNA后,扩增抗体重链、轻链可变区基因片段。然后经重叠延伸PCR装配成scFv基因并克隆入噬粒载体pDAN5中,电转化大肠杆菌TG1构建初级抗体库。制备初级库噬菌体后,感染大肠杆菌BS1365进行细胞内重组制备次级抗体库。结果:初级库库容量为3×109,在大肠杆菌BS1365中重组后得到3×1011的次级抗体库。结论:细胞内重组方法的应用可使大库容量抗体库的构建变得简单易行。构建的抗SARS病毒单链抗体次库不仅接近人类天然抗体库的水平,而且多样性好,为筛选抗SARS病毒抗原的抗体提供了保证。     

全人源肝癌噬菌体单链抗体基因的克隆及活性分析

从噬菌体单链抗体库中筛选克隆全人源肝癌抗体基因并进行活性鉴定.PCR鉴定阳性重组菌中人肝癌ScFv的插入率,以肝癌细胞SMMC-7721为抗原对所建抗体库进行4轮"吸附-洗脱-扩增"的亲和筛选.将筛选后的ScFv采用ELISA法鉴定其与人肝癌细胞的结合活性.ScFv基因插入率为70%.在亲和筛选过程中,肝癌噬菌体单链抗体得到富集,收获率逐轮提高,第4轮为第一轮的381倍.利用噬菌体抗体库技术筛选出了肝癌噬菌体单链抗体,且筛选后的抗体片段与人肝癌细胞有特异性的结合活性.     

基于RT-PCR基础上的体内重组法构建人源性胶质瘤单链抗体库

目的　构建人源性胶质瘤噬菌体抗体库 .方法　经逆转录、套式PCR从脑胶质瘤患者血淋巴细胞中扩增出抗体轻链Vκ 和重链VH 基因 .先构建Vκ 基因库 ,并使连接Vκ 和VH基因的Linker与Vκ 基因连接 ,再将VH 基因克隆入Vκ 基因库 ,即构建成约为 3.5× 10 6 的单链抗体 (ScFv)基因库 .以Loxp5 11序列替代Linker序列 ,并将ScFv克隆入pDNA5内进行重组、鉴定 ,得到新的ScFv噬菌体抗体库 .结果　表明原初级噬菌体抗体库经Cre Loxp5 11系统重组后库容量达到 8.5× 10 8,部分测序证实抗体基因与人源性抗体基因数据库同源 .结论　利用体内重组系统明显提高了所建的抗体库容量 ,为进一步筛选特异性人源性抗脑胶质瘤ScFv奠定了基础     

肌内注射rAAV2/rTNFR：Fc对大鼠胶原性类风湿关节炎模型的治疗作用

 目的 观察肌肉注射2型重组腺相关病毒/肿瘤坏死因子受体：IgG₁F_C 融合基因（rAAV2/rTNFR：Fc对大鼠类风湿关节炎模型的治疗作用。方法 皮内注射Ⅱ型胶原乳剂,诱发胶原性大鼠类风湿关节炎模型。将大鼠随机分为5组,每组10只,包括：正常对照组、模型对照组、载体对照组、地塞米松对照组和rAAV2/rTNFR：Fc肌肉注射给药组。观察各组大鼠的关节炎指数（AI、关节肿胀程度、踝关节的X线变化、组织病理改变与动物血清肿瘤坏死因子(TNF-α及其受体(TNFR水平。结果 与模型对照和载体对照组比较,肌肉注射rAAV2/rTNFR：Fc可使关节炎症明显减轻,AI降低、关节肿胀程度减轻;X线检查显示rAAV2/rTNFR：Fc给药组关节结构清晰,无明显骨质破坏。组织病理检查结果也表明,给药组关节腔内滑膜增生和炎性细胞浸润程度减轻,增生的血管翳肉芽组织减少;此外,与模型对照组和载体对照组比较,给药组血清中TNF-α水平显著下降(P<0.05,而TNFR水平明显上升(P<0.05 。结论 肌肉注射给予rAAV2/rTNFR：Fc对大鼠胶原性类风湿关节炎模型具有明显的抗炎作用。     

T4DNA连接酶对电转化效率的影响

目的 探讨T4 DNA连接酶影响电转化效率的机制并寻找提高电转化效率的方法.方法 将1μg噬粒pDAN5加入到连接反应体系中并进行沉淀、热灭活以及酚氯仿抽提等各种处理后进行电转化.结果 热灭活、酚氯仿抽提、热灭活后沉淀及热灭活后酚氯仿抽提处理后的转化效率最高(4.6×108～5.3×108),其次是沉淀处理(4.8×107),未处理的转化效率最低(4.4×106).结论 T4 DNA连接酶的活性是导致电转化效率降低的主要原因,任何可以灭活该酶活性的方法均可显著地提高转化效率.