成年动物骨骼肌细胞原代培养及转染外源基因的初步研究

目的 观察损伤对成年动物骨骼肌卫星细胞增殖的影响,以获取基因治疗自体移植的载体。方法 以阳离子脂质体介导法将ｐＲＳＶ－ＬａｃＺ或ｐＲｃｈ－ＴＨ质粒转入培养肌细胞。结果 骨骼肌损伤后,分离出的肌卫星细胞及组织块游离成肌细胞数均显著增高;外源基因能在细胞内表达。结论 损伤可诱导成年骨骼的卫星细胞增殖并促进体外增减／肌细胞成活。     

多聚乙酸亚胺介导基因转移

目的 采用一种新的多聚阳离子化合物－多聚乙酰亚胺（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ,ＰＥＩ）,作为将外源性基因转入骨骼肌细胞的介导物。方法 骨骼肌细胞取生新生ＳＤ大鼠,经胰酶消化后培养,将ＬａｃＺ基因ＤＮＡ－ＰＥＩ复合物导入骨骼肌细胞内,最后用Ｘ－ｇａｌ组织化学染色法检测已转染的细胞。结果 ＰＥＩ可作为介导剂使ＬａｃＺ基因在培养的骨骼肌细胞中表达,其表达率可达到３０％。结论 ＰＥＩ在真核细胞中实施     

RNA干扰介导的MN9D细胞中α-synuclein表达抑制及其对细胞活力的影响

目的使用载体介导的RNA干扰（RNA nterference,RNAi）方法抑制MN9D细胞中的α-synuclein基因表达,并检测其对细胞增殖和活力的影响。方法在α-synuclein的开放读码区选择两段19个核苷酸的片断,并选择一段与小鼠基因无同源性的阴性对照序列,分别设计合成单链寡核苷酸,退火融合成双链寡核苷酸。将双链寡核苷酸克隆入pENTR／Hl／TO质粒载体,鉴定正确后,转染MN9D细胞,通过筛选获得稳定的细胞克隆。使用RT-PCR、Real-timePCR、免疫细胞化学染色和Western blot方法检测细胞内的α-synuclein的表达水平,鉴定RNAi的效率。利用生长曲线和MTT法分别检测比较各组细胞的增殖和活力。结果转染pSH2／α-SYN的细胞与正常和转染pSH／CON的MN9D细胞相比,α-synucleinmRNA及蛋白水平均明显减少;而转染pSHl／α-SYN的细胞α-synucleinmRNA及蛋白水平与两组对照细胞没有明显差别。抑制α-synuclein表达不影响细胞增殖,但可以降低细胞活力。结论结果表明,SH2／α-SYN是有效的小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）序列,通过载体介导的RNAi方法可以有效抑制MN9D细胞中的α-synuclein表达,这为进一步研究α-synuclein蛋白的生理功能及其在帕金森病（Parkinson’s disease,PD）发病中的作用提供了良好的细胞模型;α-synuclein在维持MN9D细胞活力中起到重要作用,α-synuclein功能缺失会导致细胞直接或间接的损伤。     

温度敏感型基因永生化神经前体细胞系的建立

目的建立温度敏感型永生化神经前体细胞系,鉴定其细胞生长特点及表达抗原的特性. 方法利用逆转录病毒感染原代培养的胚胎13d SD大鼠中脑神经前体细胞,建立温度敏感型永生化神经前体细胞系RMN,利用免疫细胞化学、Western blot和流式细胞分析方法测定RMN细胞的特征. 结果在33℃条件下,RMN细胞呈多边形,有较短突起;细胞增殖迅速,群体倍增时间为48 h,可连续传代和冷冻保存;细胞表达SV40大T抗原,nestin蛋白和Nurrl蛋白;RMN细胞中未发现染色体倍体的异常,裸鼠接种20周后未观察到肿瘤的形成.在39℃条件下,RMN细胞增殖速度减缓,细胞形成较长突起.在含1%胎牛血清的培养基中培养1周后,RMN细胞可表达β-Ⅲ-tubulin,GFAP和Gal C等抗原,但SV40抗原表达减弱.结论RMN细胞系是SV40/tsA58基因永生化的大鼠神经前体细胞系,是具有温度敏感性及多分化潜能的前体细胞系.     

大鼠骨髓源干细胞在损伤脑组织中的分化趋势

目的 探讨迁移至损伤脑组织的骨髓源干细胞(BMDSCs)的分化趋势。方法 将雌性SD大鼠脑损伤模型在制作好24h后经尾静脉植入GFP标记的雄性SD大鼠的BMDSCs。在植入后2周、4周和8周分批取脑,分别用CD11b和GFAP荧光免疫组织化学方法检测GFP阳性细胞的性质。结果 在移植GFP标记的BMDSCs后1周,植入的GFP阳性BMDSCs占外周血白细胞总数的3.53%;移植BMDSCs后4周和8周的脑损伤病灶周围有集中分布的GFP阳性细胞,分别表达小胶质细胞的细胞表面标记CD11b和胶质纤维酸性蛋白GFAP。结论 GFP标记的BMDSCs能迁移至脑损伤病灶周围并有向小胶质细胞和星形胶质细胞分化的趋势。     

大鼠Desert Hedgehog基因的克隆和表达

目的克隆大鼠Desert Hedgehog（DHH）基因,构建其真核表达载体并转染TP67细胞;同时制备DHHcRNA正义及反义探针用于检测其在细胞中的表达。方法提取SD大鼠睾丸总RNA,RT-PCR法扩增DHHcDNA片段,连接于pGEM—TEasy载体,经测序后构建真核表达载体pLXSN／DHH并转染PT67细胞;重组质粒经限制性内切酶NotⅠ和NcoⅠ酶切、回收后,进行转录标记反应,原位杂交检测DHH在嘶7细胞中的表达。结果RT-PCR扩增得到1220bp的片段;成功构建了真核表达载体pLXSN／DHH;制备DHH正义及反义探针浓度分别为150mg／L和80mg／L;DHH在PT67细胞中有表达。结论克隆的DHH基因与大鼠Sertoli细胞的DHH基因相同,成功标记了特异、敏感的DHHcRNA探针,转染的DHH基因能够在PT67细胞中表达。     

羊膜对人脐血干细胞分化为多巴胺能神经元的作用

目的 探讨羊膜上皮细胞对人脐血干细胞定向分化为多巴胺能神经元的作用.方法 体外分离、原代培养人羊膜上皮细胞,通过高速离心制备成条件培养液(CM)对P1代脐血十细胞进行诱导,倒置相差显微镜观察细胞形念的变化,应用免疫荧光染色和免疫印迹法检测其酪氨酸羟化酶(TH)及多巴胺转运体(DAT)蛋白的表达情况.结果 P1代脐血干细胞经羊膜上皮细胞条件培养液诱导后,TH及DAT阳性细胞率明显高于对照组,与对照组比较有显著性差异(P<0.01),免疫印迹分析结果 与免疫荧光染色结果 一致.结论 羊膜上皮细胞能诱导人脐血问充质干细胞定向分化为多巴胺能神经元.     

Ⅱ型囊泡单胺转运体基因过表达对多巴胺含量影响的体外研究

目的　获得人Ⅱ型囊泡单胺转运体 (VMAT2 )基因 ,转染至MN9D细胞 ,通过检测细胞内外单胺类递质含量的变化评价VMAT2 基因促进单胺类递质循环利用的效应。　方法　从人胎脑中提取总RNA ,RT PCR方法扩增目的cDNA片段并将其重组于pGEM Easy T载体中 ,进行全序列测定。重组真核表达载体pBK RSV VMAT2 ,转染MN9D细胞 ,免疫细胞化学检测VMAT2 的表达 ,HPLC检测细胞内外单胺类递质含量的变化。　结果　RT PCR扩增到 16 37bp的带有Kozak序列的cDNA片段。原位杂交证实pAAV VMAT2 能在COS7细胞表达 ;免疫组织化学证实转基因的MN9D细胞 (实验组 )VMAT2 免疫着色明显高于对照组。高效液相色谱结果表明 ,实验组中细胞内外的多巴胺含量均升高 (P <0 0 1) ,细胞外HVA、DOPAC降低 (P <0 0 5 ) ,而胞内升高 (P <0 0 1)。　结论　克隆的VMAT2cDNA片段可在真核细胞中表达 ,该基因的过表达可促进多巴胺的循环利用 ,有望用于帕金森病的基因治疗。     

微囊化牛肾上腺嗜铬细胞多巴胺含量的检测

目的检测体外培养微囊化牛嗜铬细胞分泌多巴胺的动态变化,为用微囊化肾上腺髓质细胞移植治疗帕金森病提供实验依据。方法常规培养牛肾上腺髓质嗜铬细胞,用人工APA微囊对之微囊化后再培养20d,高效液相色谱(HPLC)动态检测多巴胺含量,并分别在光镜及电镜下观察微囊内牛嗜铬细胞的形态变化。结果牛嗜铬细胞在微囊内生长良好,在培养液内可持续检测到多巴胺。第8d左右多巴胺的分泌达到高峰,随后逐渐下降,14d后分泌量处于一种恒定的状态。结论微囊化牛嗜铬细胞分泌的多巴胺可以通透微囊,可以考虑用来进行异种细胞移植治疗帕金森病。     

转染α-突触核蛋白的SH-SY5Y细胞增强对鱼藤酮毒性的耐受

目的探讨α-突触核蛋白(α-synuc le in)在鱼藤酮处理的人类多巴胺能SH-SY5Y细胞内的作用。方法用脂质体转染的方法将-αsynuc le in基因转染入SH-SY5Y细胞内,并筛选稳定表达-αsynuc le in的细胞。经过不同浓度的鱼藤酮处理后,测定细胞活力、细胞内氧化应激和抗氧化能力。结果经鱼藤酮处理后,所有的细胞均表现为细胞活力下降和细胞内氧化应激增强。与正常SH-SY5Y细胞相比,过表达-αsynuc le in的细胞表现为较高的细胞活力和抗氧化能力(P<0.01)。结论α-synuc le in过表达可能通过增强SH-SY5Y细胞活力和抗氧化能力,来部分对抗鱼藤酮的毒性作用。