与Sertoli细胞共培养大鼠大脑皮质神经前体细胞分化中Notch信号相关基因表达分析

目的:检测与Sertoli细胞共培养条件下大鼠大脑皮质神经前体细胞分化过程中Notch信号相关分子的表达变化.方法:分离大鼠Sertoli细胞和大脑皮质神经前体细胞.神经前体细胞与Dertoli细胞共培养条件下,用Real-time PCR相对定量法,分别检测Notch受体Notch1、Notch2、Notch3、Notch4及其配体Delta1、Delta3、Jagged1、Jagged2,以及ngn1、hes1基因的表达变化.结果:培养细胞汇片后第5天,Sertoli细胞Notch1～4基本表达维持不变;其配体Jagged2表达较高,但不表达Delta1;同时也不表达ngn1、hes1.神经前体细胞Notch表达水平较高,尤以Notch1和Notch2为高;而其配体以Jagged1、Jagged2表达较高,前神经因子Hes1有较高表达,而Ngn1表达较低.细胞共培养条件下,Notch受体、配体以及Hes1与神经前体细胞组相比都有明显的下调,而Ngn1却相对有所提高.结论:Sertoli细胞可通过Notch配体的作用,调节神经前体细胞Notch信号分子的表达.在共培养条件下,Sertoli细胞对神经前体细胞Hes1表达有抑制作用,但对Ngn1有正向调节作用,从而影响神经前体细胞的分化.     

rAAV2-EM>hGAD/EM>65重组载体的构建和功能检测

目的 构建rAAV2-hGAD65重组载体,观察其体内外功能。方法 应用RT-PCR的方法克隆hGAD65基因,与AAV载体连接得到重组载体(rAAV2-hGAD65)。包装重组腺相关病毒并检测病毒的滴度。体外感染成纤维细胞后,用免疫组织化学的方法检测GAD65在细胞中的表达水平,用高效液相色谱(HPLC)法检测培养上清中γ氨基丁酸(GABA)的含量。在体实验中,向丘脑底核(STN)立体定位注射rAAV2-hGAD65后,用HPLC方法检测黑质网状部(SNr)中的GABA含量。结果 应用RT-PCR方法成功地从人胚胎端脑组织中克隆出GAD65基因的cDNA,基因测序显示与基因库中人GAD65基因序列一致,亚克隆入AAV载体并包装后所得的病毒颗粒的滴度达到4.5×10¹¹/ml。组织化学检测感染大鼠肺成纤维细胞的效率约为80%,HPLC检测培养上清中GABA的含量为(45.66±6.07)nmol/L。STN立体注射rAAV2-hGAD65后,在STN可以检测到hGAD65的表达,SNr区GABA的含量由原来的(5.66±1.07)nmol/g升高到(12.66±2.59)nmol/g。结论 成功地克隆出了人GAD65基因,并构建了AAV重组载体。AAV病毒颗粒在体外能感染成纤维细胞并具有催化谷氨酸合成GABA的功能。在体内实验中,向STN注射rAAV2-hGAD65后,可以增加黑质网状部(SNr)中的GABA含量。     

骨髓干细胞来源的星形胶质细胞参与脑损伤后胶质界膜的形成

目的探讨骨髓干细胞来源的星形胶质细胞是否参与脑损伤后胶质界膜的形成。方法将制作好的雌性Sprague-Dawley大鼠脑损伤模型24h后经尾静脉植入GFP标记的雄性Sprague-Dawley大鼠的骨髓源干细胞。在植入后2、4和8周取脑,用GFAP荧光免疫组织化学方法显示星形胶质细胞,GFP显示骨髓来源细胞,观察损伤组织边缘的胶质界膜中是否存在GFP/GFAP双阳性细胞。结果在损伤组织边缘可见骨髓干细胞来源的星形胶质细胞。结论骨髓干细胞来源星形胶质细胞参与脑损伤后胶质界膜的形成。这对脑外伤的恢复和组织工程材料的植入有重要的意义。     

不同诱导因子对人脐带血非造血干细胞神经分化的影响

目的 探讨诱导人脐带血非造血干细胞向神经细胞分化的最佳条件.方法 通过密度梯度离心法原代培养脐带血非造血干细胞;用流式细胞术分析脐带血获得的贴壁细胞的CD34、CD90、CDl66、HLA-ABC、HLA-DR等免疫表型;并用不同诱导因子组合:1.维甲酸(RA);2.表皮生长因子(EGF) 碱性成纤维细胞生长因子(bFGF);3RA EGF bFGF;4二甲基亚砜(DMSO) 丁羟基茴香醚(BHA)诱导后,用免疫荧光化学法检测各组脐带血非造血干细胞中β-微管蛋白-Ⅲ(β-tubulin-Ⅲ)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、半乳糖苷酶-C(Gal-C)等神经细胞、星型胶质细胞及少突胶质细胞的特异性标记抗原的表达.结果 脐带血非造血干细胞CD90、CD166、HLA-ABC表达阳性;无论那一种诱导因子组合,分化为少突胶质细胞的比率均高于神经元及星型胶质细胞;即各组分化为少突胶质细胞数＞神经元的细胞数＞星型胶质细胞数.对于少突胶质细胞(Ga-C)以RA EGF bFGF组合诱导率最高,达57.02%,其次是DMSO BHA诱导组.而对于神经元及星型胶质细胞的分化各组比较,以RA组最高,其次是DMSO BHA诱导组合.结论 RA对神经元及星型胶质细胞的诱导作用较好,而RA EGF bFGF组合对于少突胶质细胞诱导作用最明显.     

含酪氨羟化酶基因的逆转录病毒载体的重组与表达

含酪氨羟化酶基因的逆转录病毒载体的重组与表达首都医科大学北京神经科学研究所郑少鹏田竟生王珂赵春礼鲁强王元身徐群渊由逆转录病毒载体介导的基因转移技术可使外源目的基因被高效地转入宿主细胞内，并在其中高效表达，因此是目前基因治疗研究中应用较多的方法之一。本...     

HRP和单胺氧化酶双标记技术的研究

ＨＲＰ和单胺氧化酶双标记技术的研究首都医科大学北京神经科学研究所赵春礼，王珂，鲁强，张国风儿茶酚胺和５－ＨＴ同属单胺类，它们共同的降解途径之一是经单胺氧化酶（ＭＡＯ）脱氨基而失活。ＭＡＯ在中枢内的分布基本上与单胺类递质的分布一致。因此，利用ＭＡＯ组织...     

帕金森病模型大鼠中脑黑质磷酸化α-突触核蛋白表达增加

目的 观察鱼藤酮对大鼠中脑黑质磷酸化α-突触核蛋白(α-SYN)、酪氨酸羟化酶(TH)表达的影响.方法 利用脑立体定位技术注射微量鱼藤酮,建立急性损伤帕金森病(PD)模型.采用动物行为轨迹分析软件计算各时间点30 min内运动距离和平均运动速度.免疫组织化学检测黑质(SN)部位TH、磷酸化α-SYN的表达,并统计TH和磷酸化α-SYN阳性神经元数目.结果 PD组动物各时间点30 min内运动距离、平均运动速度低于对照组(P＜0.05,0.01).同对照组相比,损伤侧SN部位TH阳性神经元数目明显减少(P＜0.01),磷酸化α-SYN阳性神经元数目明显增加(P＜0.01).结论 PD大鼠中脑黑质磷酸化α-SYN表达增加及TH的表达明显下降,并出现运动障碍.     

α-synuclein-EGFP在体外培养SH-SY5Y细胞中过表达对包涵体形成及线粒体结构改变的影响

为了观察 α-synuclein-p EGFP真核载体在 SH-SY5 Y细胞内表达状况及其对细胞的影响 ,本研究用 L ipofect AMINE法转染 SH-SY5 Y细胞 ,用荧光显微镜检测报告基因表达产物 EGFP,用荧光免疫细胞化学法检测α-synuclein蛋白表达以及用 H-E染色、光学显微镜观察转基因表达产物在细胞内的积聚 ,电镜观察转基因细胞超微结构形态学变化 ,rhodamine12 3染色、荧光显微镜检测线粒体跨膜电位变化。结果证明 ,该载体转染 SH-SY5 Y细胞后 ,在细胞内同时表达报告基因和目的基因 ;外源基因的表达产物可在细胞内积聚形成包涵体并引起线粒体结构和功能改变。本研究结果提示 ,本实验获得的细胞模型可模拟 Parkinson病发生过程中一些基本的神经病理学特点 ,可为进一步探讨 Parkinson病患者多巴胺能神经元变性缺失机制提供依据     

GDNF转基因成纤维细胞脑内移植治疗帕金森病大鼠模型

为了观察表达胶质细胞系源性神经营养因子 (GDNF)的基因工程细胞在脑内移植后对帕金森病大鼠的治疗作用 ,将 6-羟基多巴胺脑内定位单侧 (损伤侧 )注射制备大鼠帕金森病模型。随机将动物分为实验组 (2 0只 )和对照组 (15只 ) ,分别植入GDNF和 Lac Z转基因的原代培养大鼠成纤维细胞于损伤侧纹状体内 ,动态观察动物单侧旋转行为以及多巴胺及其代谢产物 3 ,4-二羟苯乙酸和高香草酸含量的变化。结果表明 :实验组帕金森病大鼠单侧旋转行为明显减少 ,为移植前旋转圈数的 (64 .8± 5 .8) % (P<0 .0 5 ) ;其纹状体内多巴胺含量显著提高 ,恢复至移植前水平的 (14 .5± 2 .2 ) % (P<0 .0 5 ) ,而对照组仅为 (1.92± 0 .15 ) % ;转基因细胞在脑内可存活 1年以上。本研究结果提示 GDNF基因治疗对大鼠帕金森病具有潜在的临床应用价值。     

人Nurr1基因克隆及其在真核细胞中的表达

为探讨Nurr1基因治疗Parkinson病的可行性,本研究克隆了中国人核相关受体1(nuclearrelatedreceptor1,Nurr1)基因,并重组携带Nurr1基因的真核表达载体,为该研究提供分子生物学基础。实验采用反转录聚合酶链式反应(RTPCR)方法从人胎儿脑中获取Nurr1cDNA,将其克隆至pGEMTEasy载体中;测序鉴定后,重组携带Nurr1基因的逆转录病毒载体pLNCX2Nurr1;通过脂质体将重组载体转染PT67包装细胞系,用病毒上清感染NIH3T3细胞系以检测病毒滴度。结果发现,RTPCR扩增得到人Nurr1cDNA片段,序列与GenBank登录的序列一致;将Nurr1基因亚克隆至逆转录病毒载体得到插入方向正确的重组载体pLNCX2Nurr1,病毒上清滴度为2×105CFU/ml。结果表明本实验获得人Nurr1基因cDNA序列,检测到Nurr1基因在真核细胞中表达,并得到较高滴度的病毒上清。