帕金森病恒河猴模型基因治疗的实验研究

帕金森病恒河猴模型基因治疗的实验研究首都医科大学北京神经科学研究所徐群渊张进禄刘玉军赵春礼王元身王珂鲁强首都医科大学宣武医院影像中心李坤成谷晔炳选用恒河猴５只，雌雄不限，体重３～８ｋｇ。经一侧颈内动脉注射ＭＰＴＰ制成偏侧帕金森病（ＰＤ）动物模型。将经...     

两种价态锰化合物对SH-SY5Y细胞损伤作用的体外研究

为探讨两种价态（2价和3价）锰化合物对SY5Y细胞的细胞毒性和引起细胞凋亡的作用，选择了多巴胺能神经细胞SH－SY5Y细胞作为受试系统，细胞活力测定结果显示Mn^2 和Mn^3 可依时间和剂量依赖性而使细胞的存活率减少，但Mn^3 的细胞毒性作用高于Mn^2 ，相差显微镜下观察，Mn^2 和Mn^3 刺激细胞24h后，细胞变圆，贴壁状态不好，HE染色得到相似的结果，在用流式细胞仪Mn^2 和Mn^3 的致凋亡作用中发现，不同价态锰均可引起SH－SY5Y细胞发生凋亡，但Mn^3 的致凋亡作用强于Mn^2 。     

Nurrl基因在大鼠体外培养骨髓基质细胞的表达

目的：为获得高效表达孤儿核受体(orphan nuclear receptor，Nurrl)基因的骨髓基质细胞。方法：采用分子克隆技术，构建携带Nurrl基因的重组腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)载体；与包装质粒pAAV-RC和辅助质粒phelper一起用磷酸钙法转染包装细胞HEK293制备具有感染活性的AAV-Nurrl病毒粒子；用病毒上清液感染原代培养的大鼠骨髓基质细胞(Marrow stromal cells，MSCs)，并用免疫细胞化学方法检测阳性细胞。结果：经酶切鉴定和DNA测序，得到了序列正确的重组pAAV-Nurr1；感染HTl080细胞进行病毒滴度测定，每mL病毒贮存液可达10^12个阳性细胞；获得了Nurrl阳性的骨髓基质细胞，阳性率在60％以上。结论：重组AAV携带的Nurrl基因能够在MSCs中表达，本文为进一步探讨将该细胞用于帕金森病基因治疗的可能性研究奠定了基础。     

大鼠骨髓基质细胞在脑内的迁移和分化

目的研究骨髓基质细胞(bMSCs)在大鼠脑内的迁移和分化情况。方法体外分离培养大鼠四肢骨的bMSCs,原代培养8~10 d后,同时用含增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的反转录病毒上清转导bMSCs并进行抗性筛选,7~10 d可得到稳定表达EGFP的bMSCs,然后将EGFP标记的bMSCs通过侧脑室和尾静脉2种注射方式分别注入纹状体损伤的大鼠体内,进而观察bMSCs向脑内迁移和分化的情况。结果在移植后的大鼠脑内均观察到2种方式植入大鼠体内的bMSCs,这些EGFP阳性的细胞呈现出一些神经元和神经胶质细胞的形态并能表达一些神经元和神经胶质细胞的特异性标志物。结论骨髓基质细胞中确实含有能够向神经元方向分化的干细胞。     

人DAT基因的克隆及其对MN9D细胞多巴胺代谢的影响

目的:探讨人多巴胺(DA)转运体(dopamine transporter,DAT)基因过表达对单胺类递质代谢的效应。方法:从人胎脑中提取总RNA,RT-PCR方法扩增DAT cDNA片段,重组于pGEM-T-EASY载体中并进行全序列测定。重组真核表达载体pLNCX2-DAT转染MN9D细胞,Western Blot检测DAT的表达,高压液相(high-performance liquid chromatography,HPLC)法检测细胞内外DA含量的变化。结果:RT-PCR方法扩增得到1981bp的cDNA片段,测序结果表明所得到的片段与DAT序列完全一致;Westein Blot证实转染后的MN9D细胞(实验组)内DAT基因表达明显高于对照组(P0.05);HPLC结果表明实验组中细胞内外的DA含量明显高于对照组(P0.05)。结论:DAT高表达明显促进DA的循环和利用,为帕金森病的基因治疗提供了理论依据。     

Forskolin上调MN9D细胞Nurr1的表达及Nurr1过表达对酪氨酸羟化酶的影响

目的寻找能激活MN9D细胞内源性孤儿核受体（Nurr1）表达的信号分子,研究Nurr1表达增高对酪氨酸羟化酶（TH）表达的影响,探讨激活Nurr1表达的信号机制。方法用蛋白激酶A激动剂Forskolin或蛋白激酶C激动剂PMA作用于MN9D细胞,用免疫荧光细胞化学及Westernblot方法检测MN9D细胞内源性Nurr1表达的变化,以及Nurr1表达增加对TH表达的影响。利用PKA信号转导通路的特异性抑制剂H89探讨激活Nurr1表达的信号机制。结果1．从加入Forskolin1h起,直至6h,MN9D细胞Nurr1表达比未加Forskolin组明显增加（P〈0．05）;Forskolin主要增加MN9D细胞核内Nurr1含量,而细胞浆内Nurr1含量变化不明显;Forskolin作用后MN9D细胞TH表达无明显变化。2．用蛋白激酶A的特异性抑制剂H89预处理后,Forskolin仍具有增加Nurrl表达的作用。结论Forskolin可增加MN9D细胞内源性Nurr1表达及核转位,单纯Nurr1表达及核转位增加不影响MN9D细胞TH的表达,TH表达的激活可能还需要其他特殊的细胞（或神经元）环境或共激活因子的共同作用。Forskolin增加MN9D细胞内源性Nurr1表达及核转位的作用不是主要通过激活PKA信号转导通路完成的。     

人胚胎海马神经干细胞体外培养方法的建立

为建立人胚胎海马神经干细胞的体外培养方法 ,防止神经干细胞在培养过程中的分化 ,确立最佳的传代时机和方法 ,分离 1 6周人胚海马组织 ,采用无血清培养基对所分离的神经干细胞进行体外培养 ,比较不同培养条件与方法所获得的神经球数量的差异。结果 :建立了人胚胎海马神经干细胞体外培养的优化条件 ,确立了最佳传代方法与时机。提示 :人胚胎海马神经干细胞在体外抑制分化的条件下可以长期处于未分化状态增生 ,并且可多次传代。     

体外培养成人及成年大鼠肾上腺嗜铬细胞

成人及成年大鼠肾上腺髓质组织比较致密,消化困难,应选用消化能力较强的胶原酶。在体外培养条件下,嗜铬细胞较其它类型细胞贴壁能力差,以多聚赖氨酸或鼠尾胶原包被底壁有利于细胞贴壁生长。神经生长因子(NGF)可促进嗜铬细胞贴壁,存活和生长出神经轴突样突起,但是成人及成年大鼠肾上腺嗜铬细胞对于NGF的依赖程度存在种属差异。在合NGF的培养基中大鼠嗜铬细胞存活数量增加,存活时间延长,并有较多细胞发育出神经轴突样突起。成人嗜铬细胞对NGF也产生一定反应,但其依赖程度不如鼠嗜铬细胞明显。     

人GDNF在原代培养的大鼠成纤维细胞中的表达

目的：研究人脑胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）在治疗神经系统疾病中的作用，克隆其前体蛋白cDNA序列，并用于真核细胞表达，方法：提取我国自建的脑胶质瘤BT325细胞总RNA，用逆转录PCR法扩增GDNF全长cDNA并构建其真核表达载体pCI-neo-GDNF，然后转染原代培养的成纤维细胞，免疫组织化学及原位杂交检测GDNF在细胞中的表达。结果：从国人脑胶质瘤细胞中扩增到558bp的GDNF全长cDNA，并在GDNF转基因原代成纤维细胞中检测到重组GDNF的转录和表达。结论：克隆到的GDNF全长cDNA片段，可用于真核细胞表达，其转基因细胞脑内移植后应能治疗包括帕金森病的内的神经系统变性疾病。     

成年动物骨骼肌细胞原代培养及转染外源基因的初步研究

目的：观察损伤对成年动物骨骼肌卫星细胞增殖的影响,以获取基因治疗自体移植的载体。方法：以阳离子脂质体介导法将pRSVLaxZ或pRchTH质粒转入培养肌细胞。结果：骨骼肌损伤后,分离出的肌卫星细胞及组织块游离成肌细胞数均显着增高;外源基因能在细胞内表达。结论：损伤可诱导成年骨骼肌卫星细胞增殖并促进体外培养肌细胞成活。