miR⁃16/15a-/-小鼠NK细胞功能及其对结肠癌移植瘤敏感度分析

目的：观察miR?16是否通过调节NKG2D表达而影响自然杀伤（natural killer,NK）细胞的生物学功能及其抗肿瘤活性。方法：miR?16/15a-/-小鼠和对照小鼠经皮下注射MC38细胞制备结肠癌移植瘤模型,观察两组小鼠皮下实体瘤生长情况;比较普通小鼠生理或荷瘤状态下NK1.1+NKG2D+细胞和NK1.1+NKG2D?细胞内miR?16的表达;分析生理及荷瘤状态下miR?16/15a-/-小鼠NK细胞NKG2D表达、γ干扰素（interferon?γ,IFN?γ）分泌及细胞毒性作用。结果：与同品系小鼠比较,miR?16/15a-/-小鼠中MC38结肠癌移植瘤的生长受到显著抑制,生理状态小鼠NK1.1+NKG2D+细胞miR?16的表达明显低于NK1.1+NKG2D?细胞,而在荷瘤小鼠来源的两组细胞中无明显差异;与野生型小鼠相比,生理及荷瘤状态下的miR?16/15a-/-小鼠NK1.1+NKG2D+细胞的比例及NK细胞活性无明显变化。结论：miR?16/15a敲除抑制MC38结肠癌移植瘤生长,而miR?16/15a敲除小鼠体内NK细胞的比例及功能及荷瘤状态下NK细胞活性并无明显变化,提示miR?16/15a缺失并非通过NK细胞抑制MC38结肠癌移植瘤生长。     

扬州地方株HPV16 L1基因的克隆及序列分析

目的：了解扬州地方株HPV16L1基因结构特点,为研制HPV16疫苗奠定基础。方法：从感染HPV16的宫颈癌组织中提取DNA,用PCR技术获得HPV16L1基因,以pGEM-Teasy为克隆载体构建重组质粒pGEM-T-L1,进行限制性核酸内切酶及核苷酸序列分析。结果：扬州地方株与德国标准株在核苷酸序列上有7处不同,其中4处由于核苷酸的改变,其编码氨基酸也相应发生变化,与标准株的同源性为99．7％;扬州地方株与中国株之间也存在1至2处核苷酸不同,但未造成氨基酸序列改变,其同源性为99．9％。结论：扬州地方株HPV16L1基因与标准株、中国株之间均存在差异,但与后者的差异极小,未造成氨基酸改变。     

凋亡相关基因p53和bcl-2蛋白在前列腺癌的中表达及其临床意义

目的 :探讨细胞凋亡相关基因bcl 2、p5 3在前列腺癌中的表达及意义。 方法 :应用免疫组织化学ABC法 ,检测 3 6例前列腺癌 (Pca) ,2 0例前列腺增生 (BPH )组织和 11例正常前列腺组织 (NP)中bcl 2、p5 3蛋白表达。结果 :①Pca和BPH组bcl 2蛋白阳性表达率明显高于NP组 (P <0 .0 5 ) ,而Pca组与BPH组阳性率无显著性差异。Pca组 p5 3蛋白阳性表达率明显高于BPH组和NP组 (P <0 .0 5 ) ,而BPH组与NP组阳性率无显著性差异 (P >0 .0 5 )。②在Pca组中bcl 2蛋白阳性 10例 ,其中Ⅰ、Ⅱ级肿瘤组阳性 4例 ,Ⅲ、Ⅳ级肿瘤组 6例 (P <0 .0 5 ) ;p5 3蛋白阳性 12例 ,其中Ⅰ、Ⅱ级肿瘤组阳性 5例 ,Ⅲ、Ⅳ级肿瘤组 7例 (P <0 .0 5 )。显示bcl 2、p5 3蛋白表达随着病理分级的增高而增高。③p5 3蛋白表达阳性率≤ 5年生存组明显高于>5年生存组 ,呈负相关 (P <0 .0 5 )。bcl 2蛋白表达与生存期无关 (P >0 .0 5 )。结论 :p5 3、bcl 2蛋白的异常表达与前列腺癌的发生发展、病理分级及预后有关。     

同期性多灶性肺癌克隆来源的确定

应用分子生物学方法确定同期性多灶性肺癌的克隆来源 ,为肺癌的分期提供依据。方法 :对 2例肺部同期多灶性肺癌患者的每个病灶都用石蜡切片做显微解剖及蛋白酶K消化 ,提取基因组DNA ,先后两次PCR扩增K -ras第 1外显子和 p5 3外显子 5～ 9,用微型凝胶做非同位素性SSCP电泳 ,银染色后观察。对有变异电泳图型的样本用DNA序列测定去证实点突变。结果 :例 1的两个肺癌结节 ,仅 1个表现K -ras第 1外显子 12密码子突变 (GGT→TGT) ;例 2的 3个肺癌结节 ,1个表现K -ras第 1外显子 12密码子突变 (GGT→TGT) ,另 1个表现 p5 3第 5外显子 48密码子突变 (GTG→TTG) ,第 3个无突变发现。结论 :此 2例的多灶性肺癌均为不同的克隆来源。因此 ,提出应用非同位素PCR -SSCP分析 ,检测K -ras和p5 3点突变是鉴别多发性肺癌克隆起源的有效方法。     

上皮间质转化相关蛋白在肝细胞肝癌组织中的表达鉴定及其小分子RNA表达谱的研究

目的 检测E-钙黏蛋白(E-cadherin)和波形蛋白(vimentin)及其相应小分子RNA(miRNA)在原发性肝细胞肝癌(HCC)中的表达.方法 免疫组织化学检测32例HCC组织中E-cadherin和vimentin的表达,分析其与临床病理资料的关系.应用miRNA芯片筛选HCC转移相关差异表达miRNAs.选取部分差异表达miRNAs以实时定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法进行验证,利用在线靶基因预测软件对其靶基因进行预测.结果 E-cadherin在转移、低分化/未分化、大于3 cm组中的阳性表达率分别为25.0%(2/8)、35.7%(5/14)、52.9%(9/17),vimentin在上述三组的阳性表达率分别为87.5%(7/8)、71.4%(10/14)、52.9%(9/17).E-cadherin表达下调、vimentin表达上调与HCC分化(低分化/未分化)和转移明显相关(P＜0.05),而与其大小无关.miRNA芯片筛选获得36个HCC转移相关miRNAs(8个上调,28个下调).在E-cadherin(-)/vimentin(+)转移HCC中,miR-21、miR-221的表达(2.22±1.79、2.36±1.05)明显高于E-cadherin (+)/vimentin(-)无转移HCC(4.35±1.90、3.90±1.23,P＜0.05);miR-199a、miR-126的表达(4.42±0.61、3.62±0.54)明显低于E-cadherin(+)/vimentin(-)无转移HCC(2.43±0.85、2.54±1.10,P＜0.05).结论 E-cadherin(-)/vimentin(+)转移HCC与E-cadherin(+)/vimentin(-)无转移HCC的miRNA明显差异表达,其中部分差异表达miRNAs可能通过调控上皮间质转化相关分子的表达参与HCC的转移.

Abstract：

Objective To detect the expression of E-cadherin and vimentin, and their corresponding microRNAs (miRNAs) in primary heptocellular carcinoma (HCC). Methods The expression of E-cadherin and vimentin in 32 cases of HCC tissues was examined by using immunohistochemistry, and the relationship between the expression and clinicopathology was analyzed. miRNA array was used to investigate the differentially expressed miRNAs between E-cadherin ( - )/vimentin ( + ) metastasis HCC and E-cadherin ( + )/vimentin ( - ) no-metastasis HCC. Real-time polymerase chain reaction (PCR) was applied to verify the reliability of miRNA array results. We predicted target genes of the four miRNAs by combination anticipated algorithms. Results The positive rate of E-cadherin in the metastasis, poor/no differentiation, ＞3 cm groups was 25.0% (2/8), 35.7% (5/14), 52. 9% (9/17) respectively, and that of vimentin was 87.5% (7/8), 71.4% (10/14), 52.9% (9/17)respectively. The low expression of E-cadherin and high expression of vimentin in HCC was significantly correlated with metastasis and poor differentiation of HCC (P＜0. 05). miRNA array showed that 8 miRNAs were up-regulated and 28 miRNAs were down-regulated in E-cadherin ( - )/vimentin ( + ) metastasis HCC. The expression levels of miR-21 and miR-221 in E-cadherin ( - )/vimentin ( + ) metastasis HCC were 2. 22 ± 1.79 and 2. 36 ±1.05, significantly higher than those in E-cadherin ( + )/vimentin ( - ) no-metastasis HCC (4. 35 ±1.90, 3.90 ± 1.23,P＜0.05). The expression levels of miR-126 and miR-199a in E-cadherin (-)/vimentin ( + ) metastasis HCC were 4. 42 ± 0. 61 and 3.62 ± 0. 54, notably lower than those in E-cadherin ( +)/vimentin (-) no-metastasis HCC (2.43±0.85, 2.54±-1.10,P＜0.05). Conclusion miRNA differential expression profile of E-cadherin ( - )/vimentin ( + ) HCC was obtained, and some of miRNAs may play a role in metastasis of HCC by regulating epithelial to mesenchymal transition.     

5-FU诱导白血病细胞凋亡的分子机制研究

目的:检测化疗药物5氟尿嘧啶(5FU)引起的T淋巴白血病细胞凋亡,及与之相关蛋白的表达和信号通路,为探索T淋巴细胞凋亡分子机制打下基础,为相关肿瘤的治疗提供依据。方法:用5FU(10μg/mL)刺激Jurkat细胞36h以诱导细胞发生凋亡,用流式细胞术和MTS比色法检测细胞存活率,计算细胞凋亡率;用Western blot检测p53的表达和caspase3的变化;向Jurkat细胞中瞬时共转染野生型或突变型pCMV p53和pEGFP c1检测p53在5FU诱导的T淋巴细胞凋亡中的作用。结果:5FU能诱导Jurkat细胞凋亡并伴随p53表达增加及caspase3的活化;野生型p53过表达可明显增加细胞对5FU的敏感性。结论:5FU诱导的T淋巴白血病细胞凋亡的分子机制可能涉及p53及caspase3。     

人睾丸酵母双杂交cDNA文库的构建与鉴定

目的:构建应用于酵母双杂交系统的人睾丸组织cDNA文库。方法:从正常人睾丸组织总RNA中纯化出mRNA,以SMARTШTM和CDSШ为引物,合成两端具有同源臂的双链cDNA,后者与线性质粒pGADT7-Rec共转化入感受态酵母细胞Y187,两者在酵母细胞中同源重组成环形的cDNA文库质粒,收集在营养缺陷培养板上筛选出的所有克隆,即为人睾丸酵母双杂交cDNA文库。结果:构建了具有基因多样性和库容量足够大的人睾丸cDNA文库,共获得2×106个转化子,插入的双链cDNA片段的长度在0.3～4.0 kb之间。结论:利用ClontechSMART技术,成功构建了应用于酵母双杂交的人睾丸组织cDNA文库,为探讨人精子发生的分子机制奠定了基础。     

前列腺病变组织中细胞凋亡与bcl-2、bax、PCNA表达

目的　研究前列腺良、恶性病变组织中细胞增殖与凋亡及其与相关蛋白表达意义。方法　采用原位细胞凋亡标记技术 (TUNEL)及免疫组织化学ABC法对 36例前列腺癌 (PCa)、2 0例前列腺增生 (BPH)和 11例正常前列腺 (NP)组织石蜡切片bcl 2、bax、PCNA蛋白及细胞凋亡检测。结果　前列腺癌细胞凋亡指数 (AI)高于BPH和NP(P <0 0 1) ,bcl 2蛋白阳性表达者AI低于阴性者 (P <0 0 1) ,bax蛋白阳性表达者AI高于阴性者 (P <0 0 5 ) ;前列腺癌和BPH的bcl 2和PCNA蛋白阳性表达率高于NP(P <0 0 5 ) ,并随着肿瘤分级增高而增高 ;NP、BPH和前列腺癌的bax蛋白阳性表达率差异无显著性。前列腺癌细胞增殖指数 (PI)明显高于BPH(P <0 0 1) ,BPH细胞PI较NP明显增高 ,但细胞AI却显著下降。结论　细胞增殖与细胞凋亡的增加在PCa的发生和发展中起到了重要作用。在BPH的形成过程中前列腺组织细胞增殖增加而细胞凋亡减少 ,其中bcl 2和bax在细胞凋亡调节中起重要作用。     

miRNA在肝癌发生与转移中的研究进展

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是我国常见的恶性肿瘤。转移、扩散是其预后不良的主要原因。因此,探索肿瘤发生、发展和侵袭转移的分子机制,寻求新的治疗靶点,对于提高肝癌的疗效具有重要意义。microRNA简称为miRNA,通常长度为19-25个核苷酸,广泛存在于真核生物中,是一类高度保守的非编码的小分子单链RNA。miRNA通过与靶mRNA3’-UTR区完全或部分互补结合,导致靶区降解或转录后翻译抑制,从而调控靶基因的表达。miRNA具有癌基因和抑癌基因的作用,直接或间接参与肝癌发生和发展。     

冠心病猝死病例心肌细胞免疫组化研究

目的：探讨冠心病猝死病例的死因诊断方法。方法：应用LSAB法对22例疑诊为冠心病猝死病例的心肌细胞进行纤维连接蛋白、肌动蛋白及肌红蛋白的免疫组化研究，并以15例非心性死亡病例作对照。结果：22例冠心病猝死可疑病例心肌中，纤维连接蛋白染色，20例呈阳性，2例阴性；肌动蛋白染色，15例明显缺失，5例轻度缺失，2例无缺失；肌红蛋白染色，13例明显缺失，6例轻度缺失，3例无缺失。15例非心性死亡阴性对照病例，纤维连接蛋白均呈阴性，肌红蛋白及肌红蛋白均无缺失。结论：心肌细胞免疫组化检测是冠心病猝死病例死因诊断的有效手段。