人骨髓间充质干细胞联合细胞因子的无血清培养体系体外扩增脐血干细胞研究

目的 探讨以人骨髓间充质干细胞(BM-MSC)为基质的无血清培养方法,体外扩增脐血造血干细胞(CBSC),研究BM-MSC支持造血的功能和体外扩增时间的选择。方法 用含血小板生成素(TPO)、干细胞因子(SCF)、flt3／flk2配体(FL)和粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)的无血清培养液,以人BM-MSC为基质,比较体外扩增脐血CD34^ 细胞7d及14d后总细胞(TC)、CD34^ 细胞和集落形成单位(CFU)数增加倍数。结果在以人BM-MSC为基质及TPO、FL、SCF和G-CSF这四种细胞因子作用下,经体外扩增7d后TC、CD34^ 细胞、CFU-GM和CFU-C数较起始分别增加了87、16、15和26倍;14d后较起始分别增加了427、38、125和104倍,与7d扩增倍数有显著性差异。结论以人BM-MSC为基质的无血清体外培养体系可以有效扩增CBSC,有潜在的临床应用价值,扩增时间应以14d为宜。     

多西环素通过MEK/ERK信号通路促进MC3T3-E1细胞株体外成骨分化

目的：研究在体外条件下多西环素（doxycycline,DOX）对前成骨细胞株MC3T3-E1成骨分化的影响及可能机制。方法：在成骨诱导剂体外诱导MC3T3-E1细胞株成骨分化条件下,茜素红染色检测成骨细胞分化;实时定量PCR检测DOX对MC3T3-E1细胞相关成骨基因OCN、Runx2的影响;用DOX、MEK抑制剂（U0126）单独或联合处理MC3T3-E1细胞后,Western blot检测N-cadherin、p-MEK及p-ERK等蛋白的表达。结果：在MC3T3-E1细胞株体外成骨诱导分化中,加入DOX可以增强茜素红染色阳性率。DOX上调MC3T3-E1细胞相关成骨基因OCN、Runx2的表达。DOX处理MC3T3-E1细胞后,其N-cadherin蛋白表达水平下降（P <0.05）,p-MEK和p-ERK蛋白的表达增加（P <0.05）。而MEK拮抗剂（U0126）则显著上调N-cadherin蛋白表达水平,同时降低p-MEK、p-ERK水平。用U0126联合DOX处理MC3T3-E1细胞后,DOX对N-cadherin、p-MEK和p-ERK蛋白水平的影响可被U...     

MRL/lpr狼疮鼠骨髓间充质干细胞表面粘附分子N-钙粘附蛋白表达增高并伴有骨髓中B淋巴细胞生成障碍

目的:观察MRL/lpr狼疮鼠骨髓的血液生成情况及骨髓微环境中骨髓间充质干细胞(bone marrow masenchymal stem cell,BMMSC)表面的粘附分子N-钙粘附蛋白(N-cadherin)的表达水平。方法:采集MRL/lpr狼疮鼠外周血进行血细胞计数;流式细胞术检测和分析狼疮鼠骨髓各系血细胞的比例;甲基纤维素半固体集落形成试验(CFU)检测狼疮鼠骨髓中CFU-pre-B、BFU-E、CFU-GM数目。分离培养狼疮鼠的BMMSC,Western blot检测其N-cadherin的表达。最后,分别用BMP/Smad通路的激动剂BMP-2和抑制剂Noggin处理BMMSC,尔后观察狼疮鼠BMMSC的N-cadherin的表达变化。结果:与C57BL/6小鼠比较,狼疮鼠的血红蛋白、红细胞计数和血细胞比容显著降低(P0.01;n=7);狼疮鼠骨髓中B220+细胞比例和CFU-pre-B数目均明显下降(P0.05;n=5)。狼疮鼠BMMSC的粘附分子N-cadherin的表达水平明显高于对照组(P0.05;n=3)。BMP-2处理狼疮鼠BMMSC后N-cadherin的水平下降,而在Noggin处理后N-cadherin表达则上调(P0.05;n=3)。结论:MRL/lpr狼疮小鼠骨髓中B淋巴细胞生成障碍。此外,小鼠骨髓微环境中BMMSC表面的粘附分子N-cadherin水平升高,其可能参与了MRL/lpr狼疮小鼠的骨髓血液生成异常。     

骨髓间充质干细胞对造血干细胞"干性"的保持作用

目的 探讨骨髓间充质干细胞(MSCs)对造血干细胞(HSCs)"干性"的保持作用及其机制.方法 免疫磁珠分离纯化脐血HSCs-CD34+细胞,并分组培养:A组,CD34+细胞单独培养;B组,加细胞因子;C组,加细胞因子和MSCs(直接接触);D组,加细胞因子和MSCs(不接触);E组,加MSCs(直接接触);F组,加Mscs(不接触).0、7、14 d分别计扩增倍数、单位细胞数形成集落能力、CD34+比率,计数7 d时各组CD34+、CD34+CD38-比率.结果 随着时间延长扩增倍数增加(尤其B组),形成集落的能力和CD34+细胞比率渐下降,但E、F组下降不明显.结论 以MSCs为滋养层,对HSCs扩增作用不明显,但可更好地保持HSCs的"干性";这种保持"干性"的作用依赖于细胞与细胞间的相互黏附作用.     

骨髓瘤细胞株对骨髓间充质干细胞FAP和APRIL表达的影响

目的研究骨髓间充质干细胞(BMSCs)与骨髓瘤细胞株共培养对成纤维细胞激活蛋白(FAP)、增殖诱导配体(APRIL)和B细胞激活因子(BAFF)表达的影响。方法体外分离、培养BMSCs,并鉴定其成骨分化能力。实验分为BMSCs单独培养的阴性对照组(A组)、BMSCs与U266细胞共培养组(B组)和BMSCs与RPMI8226细胞共培养组(C组)。培养7d和12d后,采用RT-PCR方法检测BMSCs中FAP、APRIL和BAFF mRNA表达水平的变化。结果三组BMSCs形态相似,均具有成骨分化能力。与A组相比,B、C组培养7d后,APRIL、FAP mRNA表达降低(P<0.05),而7d和12d后的BAFF mRNA表达无统计学差异(P>0.05)。结论 BMSCs与骨髓瘤细胞株U266或RPMI8226共培养后,改变FAP和APRIL表达,从而参与骨髓瘤的病理过程。     

慢性粒细胞白血病骨髓间质干细胞NF-κB基因表达的变化及意义

目的 探讨慢性期慢性粒细胞白血病(CML)患者骨髓间质干细胞(BMMSCs)体外生长特性和核转化因子κB(NF-κB)mRNA表达的变化及意义.方法 选择5例慢性期CML患者为A组和6例健康人为B组,取骨髓单个核细胞行BMMSCs体外培养,观察BMMSCs体外生长形态并计数,绘制生长曲线.取第3、4代BMMSCs提取总RNA、逆转录RT-PCR检测NF-κB mRNA表达量.结果 CML患者BMMSCs生长活性较对照组无明显差别,但其NF-κB mRNA表达量较对照组升高(P<0.05).结论 CML患者BMMSCs中NF-κB基因高表达影响CML发病.     

应用逆转录病毒载体构建荧光标记的K562细胞模型

目的:采用逆转录病毒载体系统构建荧光标记的K562细胞模型.方法:将增强绿色荧光蛋白(EGFP)cDNA插入载体pCMV-hyg,构建重组质粒pCMV-EGFP-hyg,并与逆转录病毒载体质粒pCMV-G和pCMV-GP共转染293T细胞生产重组逆转录病毒,感染K562细胞;通过Hyg筛选建立EGFP自身标记的K562细胞模型.应用流式细胞仪及荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达.比较EGFP-K562细胞与K562细胞生长曲线.通过外周血淋巴细胞的NK活性试验观察EGFP-K562能否用于有关实验研究.结果:应用EGFP cDNA成功构建pCMV-EGFP-hyg,与逆转录病毒载体系统质粒共转染293T细胞后产生含EGFP的重组逆转录病毒,48 h收集的病毒滴度达1.5×106 CFU/ml.重组逆转录病毒感染K562细胞后,经Hyg筛选,98%以上稳定表达EGFP.长期培养20代,EGFP表达稳定,对K562细胞生长无影响.以EGFP-K562为靶细胞的NK活性试验显示40:1效靶比,孵育4 h最敏感.结论:应用逆转录病毒载体系统成功构建稳定表达绿色荧光蛋白的EGFP-K562细胞模型,NK活性试验提示EGFP-K562可用作实验研究的新型靶细胞模型.     

蛋白酶体抑制剂PS-341靶向干预多发性骨髓瘤骨髓间充质干细胞的实验研究

目的:分析蛋白酶体抑制剂PS-341对多发性骨髓瘤(MM)骨髓间充质干细胞(MSCs)凋亡及其对IL-6、IL-1β、SCF细胞因子表达的影响。方法:含10?S的1640培养液培养得到MSCs,流式细胞术(FCM)鉴定所培养细胞的表型,以终浓度分别为0 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L、150 nmol/L、200 nmol/L的PS-341作用MSCs 4 h,光学显微镜观察细胞形态改变,荧光显微镜下Annexin V-FITC/PI双染法观察细胞凋亡,反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测IL-6、IL-1β、SCF细胞因子表达的变化。结果:PS-341可诱导MSCs凋亡,与其浓度成正比;与对照组(0 nmol/L PS-341)比较,浓度分别为50 nmol/L、100 nmol/L、150 nmol/L、200 nmol/L的PS-341作用MSCs 4 h后明显抑制IL-6、IL-1β、SCF的表达(P<0.05);PS-341对IL-6和SCF的抑制与PS-341浓度成正相关(P<0.05),在初发/难治复发和完全缓解(CR)两组患者间均无显著差异;对IL-1β的抑制在CR组较初发/难治复发组更明显(P<0.05);PS-341作用后IL-1β表达的强弱对IL-6及SCF的表达无影响。结论:PS-341诱导MM患者MSCs凋亡和抑制其IL-6、IL-1β、SCF的表达,是PS-341有效治疗MM的靶点之一。     

MRL/lpr狼疮鼠骨TNF-α/NF-κB信号通路的表达

目的: 探讨系统性红斑狼疮小鼠(MRL/lpr)骨肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α, TNF-α)/细胞核因子-κB p50 (nuclear factor-κB p50,NF-κB p50)信号通路的表达。方法: 选取C3He/HeJ小鼠(对照组)和MRL/lpr狼疮小鼠(狼疮组)各6只,饲养4个月后常规制备小鼠股骨组织切片,HE染色观察骨质情况,免疫组织化学染色检测TNF-α、NF-κB p50蛋白表达情况;密度梯度离心法分离和贴壁法筛选骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMMSCs),然后培养;免疫细胞化学染色观察BMMSCs中TNF-α、NF-κB p50表达情况。结果： 与对照组比较,狼疮组小鼠骨小梁松散,出现骨质疏松,股骨TNF-α和NF-κB p50蛋白表达升高(P<0.05或P<0.01),BMMSCs中TNF-α和NF-κB p50蛋白表达亦升高(P<0.05或P<0.01)。结论：狼疮鼠骨TNF-α/NF-κB信号通路处于异常活化状态。     

淋巴瘤及骨髓瘤患者自体外周造血干细胞动员相关影响因素分析

目的:探讨单中心淋巴瘤、多发性骨髓瘤患者自体外周造血干细胞动员相关的影响因素。方法:回顾分析2012年3月至2021年12月在江苏大学附属医院行自体外周造血干细胞动员和移植的30例淋巴瘤、多发性骨髓瘤患者的临床资料,包括患者年龄、性别、疾病类型、化疗疗程、动员方案、采集次数、CD34⁺细胞计数、不良事件、移植后中性粒细胞及血小板植入天数等临床指标,分析造血干细胞动员效率的相关影响因素。结果:动员方案中VP-16药物剂量对CD34⁺细胞动员成功率有显著性影响,中剂量VP-16+G-CSF组动员成功率及优质动员率均高于高剂量VP-16+G-CSF组(P<0.05);既往化疗疗程数≤4的动员成功率高于化疗疗程数>4(100%vs 72.22%,P<0.05);淋巴瘤患者动员成功率低于多发性骨髓瘤患者(66.67%vs 94.44%,P<0.05);淋巴瘤患者接受中剂量VP-16+G-CSF的动员成功率高于高剂量VP-16+G-CSF(100%vs 42.86%,P<0.05)。患者性别、年龄、诊断至干细胞动员的时间、疾...