淫羊藿甙腹腔注射对新生大鼠卵巢发育的影响

目的应用淫羊藿甙对新生大鼠进行腹腔注射,了解其对卵泡发育和卵母细胞凋亡的影响。方法用淫羊藿甙对出生后1～8d大鼠腹腔注射50mg/（kg·d）,分别取出生后2、4、8d龄卵巢,用苏木素-伊红（hematoxylin-eoxin,HE）染色观察不同发育阶段卵泡比例,末端脱氧核苷酰基转移酶介导性dUTP切口末端标记（TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling,TUNEL）荧光染色检测卵巢内卵母细胞凋亡变化。结果在淫羊藿甙腹腔注射组的新生的鼠中,1、2d龄卵巢内未装配卵泡比例及4、8d龄卵巢内原始卵泡比例均高于对照组;各日龄组卵巢中卵母细胞TUNEL阳性率明显低于对照组。结论淫羊藿甙可能通过延缓卵母细胞巢破裂,抑制原始卵泡的发育启动,减少卵母细胞凋亡从而增加新生大鼠卵巢中卵母细胞的储备量。     

HIV感染人CD4+T细胞生物学特性的实验研究

目的观察人免疫缺陷病毒（HIV）-1SF33感染后MT4细胞超微结构、细胞周期、细胞内钙离子浓度改变，为寻找艾滋病发病机制提供研究基础。方法以HIV-1SF33实验株感染MT4细胞，72h后用P24试剂盒双抗体夹心法检测HIV抗原表达情况以验证感染是否成功。设正常MT4细胞组与HIV感染MT4细胞组，用倒置显微镜观察细胞形态，透射电镜观察细胞超微结构，激光共聚焦显微镜检测细胞内钙离子浓度，流式细胞仪检测细胞周期。结果染毒成功。染毒组细胞多散在排列，可见多核巨细胞和空泡状细胞形成；胞浆内可见大量大小均一的HIV颗粒堆积，细胞器肿胀，内质网、线粒体扩张，溶酶体体积增大，数量增多，部分细胞融合，胞浆内形成多个空泡；细胞内钙离子含量增高；HIV感染与未感染MT4细胞相比，G2-M-S期细胞比例减少，G0-G1期细胞比例增多。结论HIV感染CD4^＋T细胞后，可直接导致CD4^＋T细胞病变，如细胞肿胀，细胞内钙离子含量增高，细胞增殖减慢。     

阴道毛滴虫肌动蛋白cDNA克隆与表达

目的克隆阴道毛滴虫肌动蛋白基因片段,表达及纯化肌动蛋白重组蛋白,免疫豚鼠获得抗血清,为进一步研究肌动蛋白在阴道毛滴虫体内定位及其在细胞衰老过程中的作用奠定基础。方法应用PCR方法获得阴道毛滴虫肌动蛋白基因部分片段,并克隆入表达载体pET-41a,转化大肠埃希菌(E.coli)BL21,IPTG诱导重组质粒表达,亲和层析纯化表达产物,Brandford法测定重组蛋白含量并免疫豚鼠,用SDS-PAGE和Western-blot进行分析鉴定。结果肌动蛋白基因的PCR产物片段大小500bp;构建了阴道毛滴虫肌动蛋白基因重组表达质粒;表达了肌动蛋白重组蛋白;SDS-PAGE显示分离纯化的肌动蛋白重组蛋白为47000u;Western-blot结果表明所获得抗血清可与肌动蛋白重组蛋白在47000u及阴道毛滴虫总蛋白在41000u处特异性反应。结论重组肌动蛋白获得高效表达,其免疫豚鼠获得的抗血清可与阴道毛滴虫肌动蛋白重组蛋白反应,也可识别阴道毛滴虫虫体肌动蛋白,该抗血清可用于进一步的研究。     

能量限制对化疗大鼠卵巢的形态结构与功能的保护作用

目的探讨能量限制对环磷酰胺处理大鼠卵巢的保护作用。方法将48只10周龄大鼠随机分为对照组、能量限制组、环磷酰胺组、能量限制加环磷酰胺组。观察各组动物的动情周期,实验结束时称取卵巢重量,并进行卵巢组织形态学观察及卵泡计数,测定血清雌二醇、促黄体生成素、促卵泡生成激素评估卵巢储备功能。结果经环磷酰胺处理的大鼠出现精神萎靡、体重下降、动情周期逐渐消失,卵巢体积缩小,颗粒细胞变性、坏死,各期卵泡数均明显减少,闭锁卵泡数增加(P<0.01)。能量限制组大鼠卵巢的原始卵泡数比对照组明显增多(P<0.01),窦状卵泡数减少(P<0.01)。能量限制加环磷酰胺组的原始卵泡和初级卵泡数比环磷酰胺组明显增多(P<0.01),且卵巢组织受损程度较单用环磷酰胺轻。环磷酰胺处理组大鼠血清雌二醇显著低于对照组和能量限制组,促黄体生成素和促卵泡生成素水平则显著高于对照组和能量限制组(P<0.01)。结论能量限制模型可以抑制原始卵泡的的转化使其数量明显增多,并可以适度减轻化疗造成的结构与功能损伤,使卵巢保留有一定储备功能。     

酵母双杂交诱饵蛋白LASS1融合表达质粒的构建及鉴定

目的 构建酵母双杂交系统诱饵蛋白大鼠LASS1融合表达质粒,为进一步筛选大鼠脑神经元内与LASS1p相互作用的蛋白奠定基础.方法 应用PCR方法获得大鼠LASS1基因2个片段,分别克隆入酵母双杂交系统诱饵蛋白质粒载体pGBKT7,转染酵母菌AH109并检测重组质粒的自激活现象及毒性.利用Western印迹检测重组质粒在AH109的表达情况.结果 LASS1基因的PCR产物片段大小分别为Flag(111 bp)、Slag(109 bp);Western印迹结果表明2个重组质粒表达的蛋白均可以与抗c-Myc抗体在22 kU处特异性反应;重组质粒转化酵母后无自激活作用.结论 重组质粒pGBKT7-Flag、pGBKT7-Slag均能够在AH109内正确表达,可作为酵母双杂交系统诱饵蛋白使用.     

大鼠卵巢组织中早期卵泡发育及卵母细胞凋亡与白藜芦醇的影响

目的:观察白藜芦醇对大鼠卵巢组织中早期卵泡发育及凋亡的影响。方法:实验于2006-07/12在汕头大学医学院细胞衰老实验室完成。成年SD大鼠合笼,所生的新生雌鼠分为3组:①对照组:正常出生者,不干预。②腹腔注射组:正常出生后12h内开始腹腔注射白藜芦醇25mg/(kg·d),1次/d。③母鼠灌胃组:正常怀孕的母鼠在孕12d(以发现阴道栓为怀孕0.5d)开始进行白藜芦醇25mg/(kg·d)灌胃,1次/d,直至分娩后生下的雌鼠。各组大鼠分别在出生2,4d处死取卵巢,应用苏木精-伊红染色观察大鼠早期卵泡发育情况(计算卵母细胞巢中卵母细胞及原始卵泡和发育卵泡的比率),应用TUNEL染色观察卵母细胞凋亡的情况。结果:①腹腔注射组和母鼠灌胃组大鼠卵母细胞巢内卵母细胞比例高于对照组[2d龄:(39.78±9.22)%,(53.20±5.08)%,(15.76±6.68)%;4d龄:(9.39±1.82)%,(5.39±2.12)%,(2.62±1.18)%;P均<0.05];2d龄母鼠灌胃组和腹腔注射组大鼠原始卵泡和发育卵泡比例低于对照组[原始卵泡:(57.64±7.23)%,(46.40±5.20)%,(74.57±9.36)%;发育卵泡:(2.58±2.41)%,(4.51±4.60)%,(9.67±4.70)%;P均<0.05]。②生后第2天是大鼠卵母细胞凋亡的高峰期,母鼠灌胃组和腹腔注射组卵泡凋亡率高于对照组,但差异不显著[(9.88±3.30)%,(12.95±3.34)%,(8.50±4.13)%,P>0.05]。结论:白藜芦醇可以延缓大鼠卵巢组织中卵母细胞巢破裂,抑制原始卵泡的发育启动;但是对于卵母细胞的凋亡没有明显影响。     

淫羊藿甙腹腔注射对新生大鼠卵巢发育的影响

目的 应用淫羊藿甙对新生大鼠进行腹腔注射,了解其对卵泡发育和卵母细胞凋亡的影响.方法 用淫羊藿甙对出生后1～8 d大鼠腹腔注射50 mg/(kg·d),分别取出生后2、4、8 d龄卵巢,用苏木素-伊红(hematoxylin-eoxin,HE)染色观察不同发育阶段卵泡比例,末端脱氧核苷酰基转移酶介导性dUTP切口末端标记(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling,TUNEL)荧光染色检测卵巢内卵母细胞凋亡变化.结果 在淫羊藿甙腹腔注射组的新生的鼠中,1、2 d龄卵巢内未装配卵泡比例及4、8 d龄卵巢内原始卵泡比例均高于对照组;各日龄组卵巢中卵母细胞TUNEL阳性率明显低于对照组.结论 淫羊藿甙可能通过延缓卵母细胞巢破裂,抑制原始卵泡的发育启动,减少卵母细胞凋亡从而增加新生大鼠卵巢中卵母细胞的储备量.     

LASS1基因在鼠脑皮层中的表达研究

目的 探讨LASS1基因在大脑衰老中的作用。方法 分别从胎鼠、新生鼠、1月龄、3月龄、6月龄、11月龄、18月龄和24月龄鼠大脑皮层组织提取总RNA，RT—PCR扩增获得LASSI的cDNA片段并植入pGEM-T载体，以重组质粒载体为定量标准模板，采用Taqman荧光探针，一步法实时定量RT—PCR检测LASS1 mRNA表达，并以肌动蛋白基因（B—actin）和18S rKNA基因作为看家基因。结果在胎鼠至青壮年鼠（1—3个月龄）发育过程中大鼠脑皮层LASS1表达水平呈上调趋势，之后随年龄增长逐渐下降；β—actin表达量在胎鼠厦新生鼠明显高于成年鼠和老年鼠；18S rRNA基因表达相对稳定。结论成功建立了大鼠LASS1基因表达的荧光实时定量RT—PCR检测方法；大鼠脑皮层中LASS1基因转录水平随年龄变化呈现相应的规律性，这将为进一步研究该基因在衰老过程中的作用提供实验室依据；同时，作为看家基因用于衰老研究，18Sr RNA较β-acfin基因更为可靠。     

阴道毛滴虫RRas基因的cDNA克隆和原核表达

目的克隆和表达阴道毛滴虫RRas(TvRRas)基因,以便进一步探讨其组织定位及功能。方法应用PCR方法从构建的阴道毛滴虫cDNA表达文库中扩增TvRRas基因片段,克隆至pGEM-T载体,经PCR、酶切和测序鉴定后亚克隆至原核表达载体pET-41a,转化大肠埃希菌(E.coli)BL21,经异丙基硫代--βD-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,镍-硝基三乙酸(Ni-NTA)柱纯化表达产物后用SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行分析鉴定。结果从阴道毛滴虫cDNA表达文库中扩增的TvRRas基因片段长522bp,酶切及DNA测序证实pET-41a/TvRRas重组质粒构建正确,表达融合蛋白分子量约为45000u。结论成功构建重组原核表达质粒pET-41a/TvRRas,并能在大肠埃希菌内表达,所表达的融合蛋白分子量大小与预期一致。