LPA2受体介导LPA诱导的人支气管肺上皮细胞PAI-1表达

目的研究溶血磷脂酸（LPA）对原代培养人支气管肺上皮细胞（NHBE）表达纤溶酶原激活物抑制因子-1（PAI-1）的调节作用。方法原代培养人支气管上皮细胞培养于6孔板培养板内,经LPA诱导后,收取RNA裂解液并用实时荧光定量RT-PCR技术检测PAI-1 mRNA表达水平;利用RNA干扰技术研究LPA受体的作用。结果 LPA可诱导NHBE细胞PAI-1 mRNA表达上调且呈时间相关性,此效应可被LPA2 siRNA完全阻断。结论 LPA2受体介导LPA诱导NHBE细胞表达PAI-1。     

阴道毛滴虫衰老生物学标志分子β-半乳糖苷酶基因克隆和蛋白表达

目的:克隆并分析阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis,Tv)衰老生物学标志分子β-半乳糖苷酶(β-gal)同源基因,表达β-GAL重组蛋白。方法:从Tv cDNA表达文库中分离获得Tv β-gal同源基因的cDNA克隆,测序和序列分析。将cDNA部分片段亚克隆到原核表达载体(pQE-80L),转化宿主菌E.coli SG13009,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达,聚丙烯酰胺凝胶电泳分析鉴定。结果:在Tv cDNA文库中获得1株2445 bp的cDNA克隆。序列分析表明,该序列开放读码框有2415 bp,推测肽链具有804个氨基酸,等电点为5.4;该肽链与多种来源的β-GAL同源蛋白均具有较高同源性。用PCR扩增了该cDNA序列中的2277 bp片段,构建了pQE-80L/Tv β-gal,所表达重组蛋白产物的相对分子质量为82 ku。结论:推测该克隆是Tv β-gal的同源基因,Tv β-gal基因可以在E.coli中得到表达,为进一步研究其细胞内定位和蛋白功能奠定了基础。     

一个新的阴道毛滴虫Ras同源cDNA克隆的分离及其特征分析

Ras超家族是由一群具有保守氨基酸基序的GTP结合蛋白组成,作为双向分子开关对细胞的多种功能具有调节重要的作用。本文报告分离得到一个新的阴道毛滴虫Ras cDNA克隆,命名为TvRasC。TvRasC cDNA编码一个194氨基酸的蛋白,与其它Ras亚家族成员蛋白序列的一致性在46 %到52 %之间。序列分析表明,该蛋白序列拥有Ras亚家族保守的结合GTP结构域。进化树分析发现该基因与人类的Rit基因位于同一亚群。由于Rit家族成员不含有CAAX异戊烯化基序,而TvRasC在羧基末端有一个典型的CAAX异戊烯化基序,因此TvRasC不属于Rit家族成员。在TvRasC的效应结构域内,与位于HRas第33位的天冬氨酸对应的氨基酸残基是天冬酰胺,有研究表明这种变化将大大削弱Ras基因家族与下游效应分子Raf的结合能力。因此我们预测TvRasC可能只有低水平的GTP酶活性,这种替换有可能使Raf失去与Ras结合域相互作用,并可能导致有活性有丝分裂蛋白激酶没有刺激效应。有关TvRasC在寄生性阴道毛滴虫原虫中的作用有待进一步研究。     

潮汕地区汉族人群MTHFR基因rs1801131多态性与非综合征型唇腭裂的相关性研究

目的：研究5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）基因rs1801131位点多态性与潮汕地区汉族人群非综合征型唇腭裂（NSCL/P）的相关性。方法：收集潮汕地区汉族人群NSCL/P患儿357名、患儿父亲199名、患儿母亲198名及健康对照者354名的外周血,提取基因组DNA,应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术检测MTHFR基因rs1801131位点的基因多态性。采用卡方检验对病例组与正常对照组基因型、等位基因频率进行比较分析。在核心家庭中进行等位基因的传递不平衡检验。家系分析由FBAT2.0.2软件完成。结果：病例组及正常对照组MTHFR基因rs1801131位点基因型频率分布均符合Hardy-Weinberg平衡。病例-对照研究发现rs1801131位点基因型多态性和等位基因多态性与NSCL/P的发病风险无显著相关关系（P > 0.05）,核心家庭等位基因A或C均不存在传递不平衡（P > 0.05）,家系分析显示该人群NSCL/P的发病与rs1801131位点等位基因的分布频率无显著相关关系（P > 0.05）。结论：MTHFR基因rs1801131位点多态性与潮汕地区汉族人群NSCL/P发病无显著相关。     

酵母双杂交诱饵蛋白LASS1融合表达质粒的构建及鉴定

目的 构建酵母双杂交系统诱饵蛋白大鼠LASS1融合表达质粒,为进一步筛选大鼠脑神经元内与LASS1p相互作用的蛋白奠定基础.方法 应用PCR方法获得大鼠LASS1基因2个片段,分别克隆入酵母双杂交系统诱饵蛋白质粒载体pGBKT7,转染酵母菌AH109并检测重组质粒的自激活现象及毒性.利用Western印迹检测重组质粒在AH109的表达情况.结果 LASS1基因的PCR产物片段大小分别为Flag(111 bp)、Slag(109 bp);Western印迹结果表明2个重组质粒表达的蛋白均可以与抗c-Myc抗体在22 kU处特异性反应;重组质粒转化酵母后无自激活作用.结论 重组质粒pGBKT7-Flag、pGBKT7-Slag均能够在AH109内正确表达,可作为酵母双杂交系统诱饵蛋白使用.     

阴道毛滴虫RRas同源基因的克隆和序列分析

目的 克隆和分析阴道毛滴虫RRas同源基因，以探讨其在细胞内信号传导通路中的功能。 方法 从已构建的阴道毛滴虫cDNA表达文库中分离得到一个与人类RRas同源的cDNA克隆，用PCR扩增该cDNA克隆TvRRas相对应的基因组DNA，并对cDNA克隆及其对应的基因组DNA进行测序。利用BLASTP，RPS-BLAST和ClustalW等工具进行序列分析。 结果 TvRRas cDNA序列全长705对碱基，读码框含615对碱基，推测蛋白质序列具205个氨基酸。序列分析显示该基因的基因组DNA序列含有5′端ATG起始密码子和3′端的终止密码子，与cDNA序列完全一致，提示该基因无内含子；进一步分析表明该基因系RRas亚家族的同源基因，其氨基酸序列与人类和小鼠的RRas同源性最高（两者的一致性均为51%，相似性均为70%），同时拥有人类RRas基因高度保守的结合GTP的结构域和完全一致的效应结构域。进化树分析表明该基因与人类的RAS原癌蛋白基因分支及RRas分支聚类。 结论 获得了阴道毛滴虫RRas同源基因。     

限制能量摄入对大鼠胰岛细胞衰老及胰岛素表达的影响

目的 探讨限制能量摄人对大鼠胰岛细胞衰老及胰岛素表达的影响.方法 18月龄SD大鼠经过限制能量摄入(给予正常饮食量的60%)6个月,建立限制能量摄入动物模型.取限制能量摄人组(实验组)及对照组胰腺,行β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色并检测胰岛内p16的表达,以了解胰岛细胞衰老状态;同时检测胰岛B细胞胰岛素的表达.结果 实验组与对照组比较,胰岛内p16表达减少,分别为(0.19130±0.02852)个和(0.24526±0.03191)/p,差异有统计学意义(P＜0.01);胰岛内β-Gal染色阳性率分别为84%和100%(P＜0.01)、着色面积1.672和2.118(P＜0.05)、着色程度1.725和2.412(P＜0.05);胰岛素表达增加(201.7±35.3和187.8±26.0),差异有统计学意义(P＜0.05)结论限制能量摄入可延缓胰岛B细胞衰老,改善胰岛的分泌功能.     

阴道毛滴虫RRas基因的cDNA克隆和原核表达

目的克隆和表达阴道毛滴虫RRas(TvRRas)基因,以便进一步探讨其组织定位及功能。方法应用PCR方法从构建的阴道毛滴虫cDNA表达文库中扩增TvRRas基因片段,克隆至pGEM-T载体,经PCR、酶切和测序鉴定后亚克隆至原核表达载体pET-41a,转化大肠埃希菌(E.coli)BL21,经异丙基硫代--βD-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,镍-硝基三乙酸(Ni-NTA)柱纯化表达产物后用SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行分析鉴定。结果从阴道毛滴虫cDNA表达文库中扩增的TvRRas基因片段长522bp,酶切及DNA测序证实pET-41a/TvRRas重组质粒构建正确,表达融合蛋白分子量约为45000u。结论成功构建重组原核表达质粒pET-41a/TvRRas,并能在大肠埃希菌内表达,所表达的融合蛋白分子量大小与预期一致。     

单管扩增测序分型技术用于人类白细胞抗原-DRBl基因分型的研究

目的：用单管PCR扩增方法建立高效的人类白细胞抗原（HLA）-DRBl基因测序分型技术并探讨其应用价值。方法：合成7个5＇端特异性扩增引物和一个3’端共用引物，将上述引物混合在一起组成单个PCR反应用于120个临床样本的HLA-DRB1的DNA测序分型。结果：本组样本都能成功分型，且结果准确，重复性好。结论：本法改进了测序分型技术，具有高分辨率、高特异性和高效率的特点，值得推广应用。     

ADV-tk重组腺病毒的构建及检测

目的应用基因重组技术,构建含胸苷激酶（tk）自杀基因的复制缺陷型腺病毒（ADV-tk）,为进一步研究tk自杀基因对肿瘤的抑制作用奠定基础。方法采用细胞内同源重组法构建携带tk基因的ADV-tk,经PCR鉴定正确后进行扩增、纯化和滴度测定。重组腺病毒ADV-tk体外转染人肝癌SMMC-7721细胞,RT-PCR检测tk基因的整合和表达。建立裸鼠人肝癌动物模型,腹腔注射ADV-tk,荧光显微技术观察ADV-tk基因在肝脏的转染情况和对肿瘤细胞的抑制作用。结果构建的重组腺病毒中带有tk基因,经扩增、纯化后测得重组腺病毒滴度为1.4×10^10pfu/ml。ADV-tk体外转染SMMC-7721细胞后,RT-PCR检测显示tk基因在细胞中整合并且有效表达。体内检测结果发现ADV-tk在肝脏有明显转染,肿瘤组织中凋亡细胞明显增多。结论本研究构建的携带tk基因的复制缺陷型腺病毒获得成功,可用于下一步研究。