应用RNAi技术沉默survivin基因对肝癌细胞系BEL-7404生长的影响

目的为研究生存素survivin基因的功能及肝细胞癌（HCC）的基因治疗策略。构建针对survivin基因的siR-NA的表达载体,转染肝癌细胞系BEL-7404后评价其对survivin基因表达的抑制作用。方法依据survivin基因设计siRNA片断,构建pGenesil-1/survivin表达载体,脂质体LipofectamineTM 2000转染BEL-7404细胞。实时定量聚合酶链反应从基因转录水平检测survivin基因的表达率,应用免疫组织化学的方法检测肝癌细胞系BEL-7404中survivin蛋白表达抑制情况。结果本实验已成功构建了针对survivin基因的pGenesil-1/survivin质粒。实时定量PCR检测显示,BEL-7404细胞经特异性siRNA作用后survivin基因的表达受抑制,其Ct值由34.2降低到22.8,免疫组织化学结果显示,pGenesil-1/survivin介导的siRNA能抑制BEL-7404细胞中survivin蛋白的表达。结论构建的siRNA能特异地抑制sur-vivin靶基因在肝癌细胞株BEL-7404中的表达,为肿瘤的生物学治疗提供了新的方法和材料。     

HCC患者血清AFP、ICAM-1、乙肝标志物的表达变化及意义

目的探讨肝细胞癌（HCC）患者血清甲胎蛋白（AFP）、细胞间黏附分子（ICAM）-1与乙型肝炎病毒（HBV）感染的关系。方法采用化学发光免疫分析和ELISA法分别检测120例HCC患者（HCC组）、加例健康查体者（对照组）血清AFP、ICAM-1水平；采用ELISA法检测其五项HBV血清标志物水平。结果HCC组中107例HBV五项标志阳性，HBV总感染率为89.2％，以HBsAg、抗-HBe和抗-HBc-IgG阳性模式多见，占44.9％。HCC组AFP、ICAM-1水平明显高于对照组（P均〈0.01）。AFP与ICAM-1水平呈正相关（r=0.627，P=0.0081）。结论HBV感染是HCC发生的一个重要的危险因素，AFP、ICAM-1联合检测有助于HCC的早期诊断。     

肝癌患者及正常人群中黑色素瘤相关抗原1的基因多态性

目的 研究黑色素瘤相关抗原1(MAGE-1)在中国肝癌患者中的表达，并阐明MAGE-1基因变异是肿瘤细胞内的突变还是单核苷酸多态性(SNP)，以及基因变异在人群中的分布状况。方法 提取19例原发性肝癌(HCC)患者的癌组织、癌旁组织总RNA，用逆转录-多聚合酶链反应(RTPCR)方法检测组织MAGE-1基因mRNA的表达，并通过PCR产物测序分析编码基因是否存在变异；提取HCC患者癌组织、癌旁组织和外周血细胞基因组DNA，以及23例正常献血员外周血细胞基因组DNA，分析MAGE-1编码基因的变异状况并利用软件对变异抗原蛋白的生物学意义进行了初步探讨。结果 癌组织中MAGE-1表达阳性率为47．4％(9／19)，癌旁组织无表达。序列测定显示，MAGE-1 cDNA编码基因存在3种类型：一类是Ⅰ型(GenBank M77481)，发生率为11．1％(1／9)；另一类型(C159T，A272G，G393A)发生率为55．6％(5／9)，称之为TGA型，导致编码的2个氨基酸的改变分别是T32A和R72Q；第三种类型(A272G，C991T，A1125G)发生率为33．3％(3／9)，仅A272G引起一个氨基酸的替换(T32A)，称之为GTG型。经对基因组DNA分析，证实以上3种基因类型不是肝癌组织的基因突变，而是SNP，其在肝癌患者和正常献血员中分布的比例分别为：Ⅰ型占26．3％(5／19)和60．9％(14／23)；TGA型占57．9％(11／19)和47．8％(11／23)，GTG型占21．1％(4／19)和21．7％(5／23)。TGA型和GTG型的序列已被GenBank收录，编号为AF463515和AY148486。在男性研究对象中，SNP型别在是否患有HCC及是否表达MAGE1抗原的患者中的分布差异均无显著性。SNP可能产生多个新的能与人白细胞抗原结合的抗原表位。利用多个模块从头搭建的方法，得到Ⅰ型和TGA型的蛋白三维空间结构模型。结论 MAGE-1在HCC患者的癌组织中表达，发现MAGE-1存在3种高频分布的SNP类型，尝试建立了MAGE-1蛋白的三维空间模型，这为进一步研究不同的MAGEI-1抗原性肽疫苗奠定了基础。     

凋亡抑制因子survivin在肝细胞肝癌的表达及临床意义

目的:探讨survivin mRNA在肝细胞肝癌(HCC)及癌旁组织的表达及意义。方法:用逆转录聚合酶链反应测定32例HCC癌组织及癌旁组织中survivin mRNA的表达。结果:Survivin mRNA在HCC组织中高度表达,阳性率为65.6%,癌旁组织中未见表达,Survivin mRNA的表达与HCC门静脉癌栓发生密切相关(P<0.05),而与其它指标无明显差异。结论:Survivin mRNA高表达可以作为判断HCC侵袭性和进展的一个潜在重要指标。     

肝细胞肝癌患者血清和组织细胞间粘附分子-1及其mRNA的表达

目的了解肝细胞肝癌患者血清和组织细胞间粘附分子-1(ICAM-1)及其mRNA的表达,明确血清可溶性ICAM-1(sICAM-1)的来源。方法应用酶联免疫吸附试验(ELISA)分析、免疫组织化学及逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)等技术,测定151例肝细胞肝癌(HCC)血清、组织ICAM-1及其mRNA的表达,并与甲胎蛋白(AFP)进行同步分析。结果151例HCCsICAM-1明显高于各对照组,73%的患者sICAM-1＞1000μg/L。肝癌组织中ICAM-1的表达阳性率为94.2%,AFP为62.9%。ICAM-1mRNA的表达与肝细胞的恶变与否及患者血清sICAM-1的水平密切相关,它在癌组织及癌旁组织中的表达率分别为65.1%和30.2%,正常肝组织均无表达。结论HCC患者血清sICAM-1的高水平与其蛋白分子在组织中的过度表达一致,并受其相关基因的调控,肝细胞恶变则是sICAM-1表达的病理学基础。测定sICAM-1对监测HCC及其术后复发具有一定的临床意义。     

甲胎蛋白阴性肝细胞癌血清细胞间粘附分子-1的测定

目的　探讨甲胎蛋白 (AFP)阴性的肝细胞癌患者血清细胞间粘附分子 1(sICAM 1)测定在肝细胞癌诊治中的价值。方法　应用酶联免疫吸附分析法测定 46例AFP阴性肝细胞癌sICAM 1水平及外科治疗前后的改变。结果　 46例中 ,AFP中位值 8.6 μg/L ,sICAM 1中位值1146 μg/L ,其中sICAM 1>70 0 μg/L有 36例 (78% ) ,>10 0 0 μg/L有 2 1例 (46 % )。19例外科治疗前后sICAM 1中位数分别是 12 5 8μg/L和 745 μg/L。 19例中 6例术后肿瘤复发 ,确诊时AFP中位值 15 μg/L ,sICAM 112 5 4μg/L。 结论　sICAM 1测定可进一步提高AFP阴性肝细胞癌的诊断率 ,同时可作为疗效判断和复发监测的指标     

阻塞性黄疸患者血清及胆汁细胞间粘附分子-1的测定

目的探讨血清及胆汁中细胞间粘附分子-1(sICAM-1、bICAM-1)在胆道阻塞性黄疸鉴别诊断中的价值.方法应用酶联免疫吸附分析测定24例胆道恶性肿瘤和21例胆道良性疾病患者sICAM-1和bICAM-1水平.结果24例恶性黄疸sICAM-1平均水平为(2343±1312)ng/ml,21例良性黄疸为(446±219)ng/ml,两组比较有极显著差异(P＜0.01);83%肿瘤患者sICAM-1＞1000ng/ml,而良性疾病患者全部低于1000ng/ml.bICAM-1水平两组间无显著差异.结论测定sICAM-1,当其水平＞1000ng/ml时,在阻塞性黄疸的鉴别诊断上有一定的临床价值.[     

NY-ESO-1和MAGE-A3抗原肽诱导肝癌患者的免疫应答研究

目的利用合成的HLA-A02限制性NY—ESO-1 p157—165或MAGE—A3p271—279抗原肽,体外通过抗原递呈细胞诱导HCC患者外周血T淋巴细胞,从而成功诱导出特异性CD8^＋T淋巴细胞免疫应答。方法通过SSP方法筛选20例HLA—A＊02的HCC患者的HLA亚型;通过逆转录多聚酶链反应和测序分析NY—ESO-1和MAGE—A3在肝癌组织中的表达以及多肽表位密集区的核苷酸变异状况;体外用细胞因子培养HCC患者外周血来源的树突状细胞（DC）;人工合成HLA—A＊02限制性NY—ESO-1p157—165或MAGE—A3 p271—279多肽,直接或用去除CD8^＋T淋巴细胞的PBMC或DC递呈,体外同T淋巴细胞孵育16d后,利用Elispot、细胞内细胞因子染色和四聚体实验检测T细胞免疫应答。结果20例HLA—A＊02患者中,NY-ESO-1mRNA阳性患者为11例,MAGE—A3mRNA阳性患者12例。中国HCC患者表达的NY—ESO-1和MAGE—A3序列高度保守。经多肽直接或用去除CD8^＋T淋巴细胞的PBMC或DC递呈,体外活化外周血T淋巴细胞,4例（36．4％）NY—ESO-1阳性HCC患者以及4例（33．3％）MAGE．A3患者产生针对多肽特异性的CD8’T细胞免疫应答。不同HLA—A＊02亚型HCC患者可产生针对NY—ESO-1p157—165或MAGE—A3p271—279抗原肽的免疫应答。结论NY—ESO-1p157-165或MAGE—A3p271—279抗原肽可以诱导出针对抗原肽的特异性CD8^＋T淋巴细胞免疫应答。提示HLA—A＊02限制性的NY-ESO-1 p157-165或MAGE—A3p271—279抗原肽可以作为有潜力的肝癌免疫治疗疫苗。     

sICAM-1、CA19—9、CEA三种肿瘤标志物联合检测在胆管癌诊断中的价值

目的探讨3种肿瘤标志物联合应用在胆管癌诊断、疗效判断中的价值。方法利用酶联免疫吸附法（EusA）检测35例胆管癌及50例胆道良性疾病患者的血清细胞间黏附分子-1（sICAM-1）水平,同时用电化学发光免疫法检测糖类抗原19．9（CA19—9）、癌胚抗原（CEA）的水平。结果血清CA19．9在胆管癌中敏感性为80％、特异性为86％,在各项指标中最高,CA19—9与sICAM-1联合应用敏感性提升到88．6％,特异性为80．0％。结论CA19—9与sICAM-1联合应用,检测胆管癌的敏感性和特异性均较好。