人抗HBsAg单链抗体-Tat融合基因的构建、表达及表达产物的活性鉴定

目的: 构建人抗HBsAg单链抗体-Tat蛋白转导结构域(ScFv-Tat)融合基因,在大肠杆菌中进行表达,并分析ScFv-Tat融合蛋白的活性及内化情况. 方法: 设计引物扩增人抗HBsAg单链抗体基因,克隆入含有蛋白转导结构域Tat序列的原核表达载体pTAT-HA,在大肠杆菌BL2l(DE3)LysS内诱导融合蛋白表达. 表达产物用SDS-PAGE及Western blot鉴定,用亲和层析柱纯化. 间接ELISA和ELISA竞争抑制实验分析ScFv-Tat融合蛋白的亲和活性,将纯化蛋白与HBsAg阳性或阴性肝癌细胞共孵育后,免疫细胞化学染色分析ScFv-Tat融合蛋白的结合及内化情况. 结果: 成功地构建了人抗HBsAg单链抗体-Tat融合蛋白的原核表达载体,在IPTG诱导下获得了表达,表达的ScFv-Tat融合蛋白具有与HBsAg结合的活性,并且能够特异性内化入HBsAg阳性肝癌细胞. 结论: 单链抗体与Tat蛋白转导结构域融合后,实现了ScFv-Tat融合蛋白的特异性内化,为该单链抗体的进一步应用奠定了基础.     

以恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1的17区片段基因为基础的复合核酸疫苗诱导小鼠体液免疫反应的研究

目的: 检测以恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1 的17 区片段基因为基础的复合核酸疫苗VR1012/TPA/HG-MSP1-17(分泌性)和VR1012/HG-MSP1-17(非分泌性)诱导小鼠的体液免疫反应。方法: 分别用分泌性与非分泌性核酸疫苗肌注免疫小鼠。用间接ELISA法测定小鼠血清的特异性抗体。结果: 每只小鼠经3 次100 μg/100μl非分泌性核酸疫苗免疫后, BALB/c小鼠和C57BL/6 小鼠均产生明显的抗HG和抗真菌表达的MSP1 17 区蛋白(YMSP119 )抗体。但总体抗体水平不高。BALB/c小鼠经3 次200 μg/100 μl非分泌性核酸疫苗免疫后, 产生较高的抗HG抗体, 但抗MSP1-17 的抗体无明显变化。经3 次200 μg/100 μl分泌性核酸疫苗免疫后, 只产生较低的抗HG抗体。结论: 非分泌性核酸疫苗较分泌性核酸疫苗具有更强的免疫原性     

原虫基因转染的研究进展

随着恶性疟原虫 (Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ,Ｐ ｆ .)2号[1] 、9号[2 ] 和 3号[3] 染色体序列的相继明了 ,关于Ｐ ｆ.基因组的研究大大向前迈进了一步 ,在未来的 2～ 3年内 ,将有可能完成其全部基因组序列分析 ,疟原虫研究即将或已经进入后基因组时代[4 ] 。对疟原虫各种基因及其基因产物的功能研究是发现有效疫苗和抗疟药物作用靶位的必要前提 ,但许多基因的功能 ,尤其是与疟原虫致病力有关的重要基因的功能尚未得以阐明 ,因而影响了疟疾防治工作进展。以往的基因功能研究局限于与已知功能基因的比较和间接地推测 ,近年来…     

单纯疱疹病毒I型胸苷激酶基因部分缺失 重组质粒的构建及序列分析

目的：构建ＨＳＶ１ 型胸苷激酶基因部分缺失的重组质粒并进行序列测定。方法：以ｐ ＵＣ１８／ ＴＫ 重组质粒ＤＮＡ 为模板,用ＰＣＲ 方法扩增ＴＫ５′端５０３ｂｐ 基因片段,并将扩增的片段克隆入载体ｐ ＵＣ１８ 中（ｐ ＵＣ１８／ＴＫ１） ;用Ｐｓｔ Ｉ 和Ｈｉｎｄ Ⅲ双酶切ｐＵＣ１８／ ＴＫ, 获得ＴＫ３′端３８３ｂｐ 片段, 将此酶切片段克隆入ｐＵＣ１８／ ＴＫ１ 中, 并进行测序。结果： 构建成重组质粒ｐＵＣ１８／ ＴＫ－ 。经酶切鉴定获得１ 条约９００ ｂｐ 的基因片段; 序列测定证实, ＨＳＶ１１７ｓｙｎ ＋ ＴＫ 基因缺失了第４９３ ～７４４ 位２５１ 对碱基。结论：成功地构建了部分缺失的ＨＳＶ１／ＴＫ－ 基因重组质粒,为研制其突变株奠定了基础。     

恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1—17区基因的原核表达,纯化及表？…

为进一步研究和应用恶性疟原虫裂殖子表面蛋白１的１７区基因,本文原核表达了ＦＵＰ株ＭＳＰ１的１７区基因,并纯化及鉴定了表达蛋白。方法将ＭＳＰ１－１７基因片段克隆入原核表达载体ｐＧＥＸ－４Ｔ－１,形成ｐＧＥＸ－４Ｔ－１／ＭＳＰ１－１７,ＩＰＴＧ诱导ｐＧＥＸ－４５－１／ＭＳＰ１－１转化的ＢＬ２１菌,纯化并用ＭＳＰ１－１７特异性生有达产物。结果成功地构建了ｐＧＥＸ－４Ｔ－１／ＭＳＰ１－１７,转化菌经诱导表     

枸橼酸钠抗凝剂对疟原虫生长活性的影响

目的　了解枸橼酸钠抗凝剂对疟原虫生长活性的影响。　方法　将疟原虫经抗凝剂(ACD,CD和SC)处理后以感染率为指标检测抗凝剂对虫体的影响。未同步化的恶性疟原虫分别使用3种不同浓度抗凝剂于37℃作用3h。处理后的红细胞与正常虫体混合,同时处理后的虫体与正常红细胞混合,随后观察两种培养混合物的感染率以确定抗凝剂作用的靶细胞。同上处理期同步化的疟原虫(环状体,滋养体和裂殖体)以观察抗凝剂作用的期特异性。将伯氏疟原虫用抗凝剂处理后接种小鼠,通过感染率的变化观察抗凝剂对鼠疟的影响。　结果　 3种抗凝剂均可抑制疟原虫的生长,其中ACD影响最甚。以抗凝剂分别处理红细胞和疟原虫,结果表明抗凝剂作用于虫体而非红细胞。处理同步化的虫体表明抗凝剂对裂殖体的抑制最为显著。同样处理伯氏疟原虫后接种小鼠进一步验证了抗凝剂对恶性疟原虫作用的抑制性效应。　结论　ACD对疟原虫的抑制性效应最为明显,SC是疟原虫试验中枸橼酸钠抗凝剂的首选。     

单纯疱疹病毒Ⅰ形胸苷激酶基因在大肠杆菌中的融合表达

用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切已构建的含单纯疱疹病毒I型胸苷激酶(HSV-1TK)基因的pUC18/TK质粒,将切出的TK基因片段克隆入原核表达载体pWR450-1中,构建成HSV-1TK基因重组表达质粒pWR450-1/TK。以HSV-1TK特异性引物TK1For和TK2Rev进行PCR鉴定可扩增出预期的503bp的TK基因编码区部分序列;EcoRⅠ和HindⅢ双酶切质粒pWR450-1/TK,可切出约1150bp的DNA片段,表明重组质粒中已插入HSV-1TK基因片段。用IPTG诱导pWR450-1/TK/JM109,表达出相对分子质量（Mr）约为97000的TK和β-半乳糖苷酶(Mr55000)融合蛋白。薄层扫描显示,该融合蛋白含量占菌体蛋白总量的27.47％。     

大鼠重组EPO结合蛋白的表达纯化及活性鉴定

EPO是调控骨髓红系造血的关键因子，其与红系祖细胞表面的特异受体EPO—R结合引发胞内信号机制，防止细胞凋亡并促进其增殖和分化。EPO—R胞外域是与EPO发生结合的受体区段，又称为EPO结合蛋白（EBP）。迄今，采用基因工程方法制备的EBP主要被应用于受体一配体结合特性及物理结构研究，其在治疗EPO反应性增生失调如红白血病和红细胞增多症中的可能性探讨尚未见报道。我们依据EPO-R与EPO结合的化学计量特性设计了串联融合的双体结合蛋白，采用原核系统进行表达，对其体内外结合活性进行了鉴定。     

复合PCR系统检测间日疟原虫的应用研究

应用一种简易、快速的复合 PCR扩增系统检测间日疟原虫 (P.v)及混合感染。方法 :以间日疟原虫和恶性疟原虫 (P.f)小亚单位核糖体核糖核酸基因 (SSUr DNA)特定片段为靶基因 ,设计并合成引物 ,建立复合 PCR扩增系统。采用煮沸法快速制备 DNA模板研究该系统的敏感性和特异性 ,并用于临床血样的检测。结果 :从间日疟原虫和恶性疟原虫感染血样中分别扩增出分子量大小为 70 5bp和 575bp的特定扩增带。而食蟹猴疟原虫、诺氏疟原虫及正常人血样均无扩增带出现。单独检测 P.v敏感度达到 0 .1 5× 1 0 -5(约 7个原虫 /μl全血 ) ,在 P.f存在的情况下检测 P.v敏感度为 0 .1 5× 1 0 -4 。检测 1 32例疟区门诊病人冻存血标本 ,1 0 4份与镜检法结果相同。并发现 1 4份混合感染和 5份为镜检虫种鉴别失误。结论 :该系统敏感性高 ,特异性强 ,操作简单 ,并可在一次扩增中同时检出间日疟原虫和恶性疟原虫 ,具有一定的推广应用价值。