幽门螺杆菌尿素酶B亚单位编码基因的克隆与序列分析

目的 幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)尿素酶B亚单位的编码基因(ureB)的克隆和序列分析，为H．pylori基因工程疫苗的研究奠定基础。方法应用PCR方法获得国内分离H．pylori菌株MEI，HP27和国际标准参考株H．pylori的ureB基因，通过定向克隆的方法分别插入克隆载体pNEB193中，用质粒酶切电泳和特异PCR方法鉴定重组质粒。克隆基因经测序后进行核苷酸和氨基酸的同源性比较。结果 重组质粒经双酶切后得到1．71kb的ureB基因片段，特异PCR可扩增出ureB基因片段，证实H．pylori ureB基因的重组克隆质粒构建成功。经测序，国内分离H．pylori MEL-HP27的ureB基因全长1710bp( Genbank收录号：AY295085)，编码由569个氨基酸残基组成的肽链，ureB基因序列与GenBank公布的H．pylori相应基因同源性高达96．08％～98．30％，氨基酸序列同源性在98．77％．99．82％之间。结论 成功克隆了MEL-HP27菌株的ureB基因，其核苷酸序列与国际参考株NCTC11637的同源性为97．67％。     

幽门螺杆菌脂蛋白基因的克隆和生物信息学分析

目的完成幽门螺杆菌(Hp)郑州分离株MEL-HP27脂蛋白(lipoprotein)基因lpp20的克隆和测序;分析该基因序列的变异性和表达蛋白的化学及免疫学特征,为Hp疫苗抗原的筛选奠定基础。方法用PCR方法从MEL-HP27的染色体DNA中扩增lpp20基因片段,将其与载体pNEB193连接后,用于转化大肠杆菌JM109,通过酶切和测序鉴定重组质粒。应用生物信息学软件Omiga2.0、GeneDoc2.3和GenBank、Swiss-port数据库对7个Hp菌株(MEL-HP27、60190、Chongqing、CH-CTX1、J99、17874、26695)的lpp20基因序列进行同源性比较,并对该基因编码蛋白的主要化学特征和抗原结构域进行分析。结果Hplpp20基因的核苷酸序列长度为528bp,不同菌株间的同源性为96.0%~98.1%。lpp20基因编码的氨基酸序列长度为175aa,不同菌株间的同源性为98.3%~100%。MEL-HP27lpp20表达蛋白的分子量为19.122kDa,等电点为9.950,具有2个抗原性结构域。结论Hplpp20基因的核苷酸序列和对应的氨基酸序列均具有较高的保守性,但保守性低于100%,采用该基因表达蛋白作为疫苗和诊断抗原时,有必要考虑人群感染的优势菌株的遗传特征,以提高免疫保护的覆盖率和免疫诊断的敏感性。Hplpp20基因编码的蛋白具有典型抗原分子的结构特征,有望成为Hp疫苗候选抗原。     

霍乱弧菌O139和El Tor菌株毒力岛区域分子特征比较

目的:比较O139霍乱弧菌(VC O139)菌株MO45基因组与O1群El Tor霍乱弧菌(EVC)菌株N16961基因组中毒力岛(VPI)区域分子特征.方法:制备霍乱弧菌VPI上游VC0815基因探针.从VC O139菌株MO45基因组文库中筛选一个既含有VC0815基因又含有tcpA基因的克隆,命名为pCOSVC081545,绘制pCOSVC081545 VPI上游片段的限制性酶切图谱,并与N16961同段序列的限制性酶切图谱进行比较.结果与结论:pCOSVC081545和N16961中VPI上游约1 500 bp片段的限制性酶切图谱基本相同,支持O139霍乱弧菌是EVC O抗原突变而来的观点.     

幽门螺杆菌融合蛋白HspA-UreB在大肠杆菌中的表达与鉴定

目的在大肠杆菌中表达幽门螺杆菌(简称Hp)HspA-UreB融合蛋白,并探索其免疫反应性,为Hp基因工程疫苗的研制奠定基础。方法用PCR方法扩增郑州分离Hp菌株MEL-HP27的hspA和ureB基因,分别克隆入pNEB193中。测序后,回收两种基因片段,并以hspA-ureB的顺序连接插入原核表达载体pMAL-C2x进行融合表达。采用蛋白印迹法对表达产物进行鉴定。结果特异PCR法和酶切鉴定证实融合基因hspA-ureB克隆入表达载体中;重组质粒转化大肠杆菌TB1后,经IPTG诱导3h,SDS-PAGE电泳显示在119kDa处出现一条特异蛋白带,即麦芽糖结合蛋白(MBP)与HspA-UreB的融合表达形式,约占细菌总体蛋白含量的31%;该融合蛋白与Hp免疫小鼠血清和Hp阳性病人血清的Westernblot分析结果显示,在119kDa处出现特异杂交带。结论成功地在大肠杆菌中实现了Hp融合蛋白HspA-UreB的高效表达,并证实其具有良好的免疫反应性。     

幽门螺杆菌融合蛋白HspA-UreB在大肠杆菌中的温控表达及其免疫反应性检测

目的：在温控表达载体pBV220中实现幽门螺杆菌(H．pylori)融合蛋白HspA-UreB的表达,并研究其免疫反应性。方法：含重组表达质粒pBV-HU27的人肠杆菌DH5α经30℃增菌后,存42℃下诱导表达,SDS-PAGE分析融合蛋白表达含量,与H．pylori全菌免疫小鼠血清和H．pylori感染患者血清进行Western blot分析,检测融合蛋白的免疫反应性。结果：SDS-PAGE分析结果显示存76500处出现特异蛋白带,诱导4h即可达到最高量,融合蛋白HspA-UreB占全菌蛋白含量的10％,该融合蛋白可以被H．pylori免疫小鼠血清和H．pylori阳性患者血清中的相应抗体所识别。结论：H．pylori融合蛋白HspA-UreB可以在温控表达载体中正确表达,且具有良好的免疫反应性。     

乳酸菌中幽门螺杆菌ureB基因的食品级表达与优化

目的:以乳酸乳球菌(Lactococcus lactis,L.lactis)为宿主菌构建幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)尿素酶B(UreB)的食品级表达系统.方法:从重组质粒pMD19-T-ureB上酶切得到ureB基因片段,与含有筛选标记lacF基因的L.lactis表达载体pN...     

蟒河污染对人群微核发生率的影响

目的 :探讨黄河支流蟒河污染对沿岸人群微核发生率的影响。方法 :采用“改良人体外周血淋巴细胞微核检测方法” ,对污染区和对照区居民进行了外周血淋巴细胞微核检查。结果 :污染区居民外周血淋巴细胞微核率( 4 .65‰ )、微核细胞率 ( 4 .18‰ )明显高于对照区 ( 2 .2 1‰、2 .0 3‰ )。结论 :蟒河污染对沿岸居民遗传物质造成了一定的损伤。     

旋毛虫与伪旋毛虫肌幼虫抗原的SDS-PAGE和双向电泳分析

目的鉴定旋毛虫(Trichinella spiralis,T1)与伪旋毛虫(T.pseudospiralis,T4)肌幼虫的差异蛋白。方法应用SDS-PAGE和双向电泳(two-dimensional gel electrophoresis,2-DE)对T1、T4肌幼虫的可溶性抗原与培养24h的ES抗原的蛋白组分进行分析。结果SDS-PAGE显示,T1肌幼虫可溶性抗原有22条蛋白带(221.62kDa～14.88kDa),其中6条为T1特异性蛋白带(59.72、44.37、23.66、22.36、18.26、16.34kDa);T4可溶性抗原蛋白有18条带(185.28kDa～14.27kDa),其中4条为T4特异性蛋白带(132.60、119.30、35.26、31.02kDa)。T1的ES抗原有10条蛋白带(113.21kDa～14.37kDa),T4的ES抗原有9条蛋白带(104.71kDa～14.51kDa),T1、T4肌幼虫ES抗原的蛋白带均不相同。2-DE显示,T1可溶性抗原有193±12个蛋白点,分子量主要为11kDa～22kDa、25kDa～64kDa及100kDa～144kDa,所对应的等电点(pI)分别为4.7～8.2、4.5～6.5及5～7;T4可溶性抗原有175±9个蛋白点,分子量主要为12kDa～21kDa及25kDa～90kDa,所对应的pI分别为4～9.5与4.5～9.6。T1的ES抗原具有82±6个蛋白点,分子量主要为13kDa～16kDa、18kDa～22kDa及40kDa～55kDa,所对应的pI分别为4～7、3.8～6.2及5～9;T4的ES抗原具有69±5个蛋白点,分子量主要为10kDa～15kDa、17kDa～25kDa及29kDa～55kDa,所对应的pI分别为4.7～6.5、4.6～6及5～7。结论旋毛虫肌幼虫可溶性抗原及ES抗原的蛋白组分与伪旋毛虫的明显不同。     

幽门螺杆菌脂蛋白基因的重组表达和免疫活性鉴定

目的制备幽门螺杆菌(Hp)Lpp20重组蛋白(rLpp20),鉴定其免疫活性,为Hp疫苗和免疫诊断研究提供候选抗原。方法采用基因克隆技术将Hplpp20基因克隆到表达载体pMAL-c2X中,用重组质粒转化E.coliTB1。采用IPTG诱导lpp20基因与麦芽糖结合蛋白(Maltose binding protein,MBP)基因融合表达,用多糖树脂亲和层析方法纯化表达的融合蛋白(MBP-rLpp20)。将MAP-rLpp20用蛋白因子FactorXa酶切,得到不带MBP的rLpp20。分别用MAP-rLpp20、rLpp20和Hp全菌抗原免疫小鼠,用Western blot检测MBP-rLpp20和rLpp20的抗原活性。结果表达的MBP-rLpp20的相对分子质量为60×103,表达量占菌体总蛋白的34.1%,占可溶性蛋白的14.2%。经酶切和纯化得到的rLpp20的相对分子质量为15×103。纯化制备的MBP-Lpp20和rLpp20的纯度分别为90.4%和91.2%,且与相应免疫小鼠血清及Hp全菌抗原免疫小鼠血清均能发生阳性反应。结论该研究成功制备了纯度较高的MAP-Lpp20和rLpp20蛋白;这两种重组蛋白均具有免疫活性,对Hp疫苗和免疫诊断研究具有应用价值。