幽门螺杆菌lpp20基因的克隆及序列分析

幽门螺杆菌 (Hp)lpp2 0基因编码Hp外膜上的一种相对分子质量约为 18× 10 3的脂蛋白 (Lpp2 0 )。有研究表明 ,Lpp2 0具有良好的免疫原性和免疫保护性 ,是一种理想的疫苗候选抗原。本研究对Hp郑州分离株MEL HP2 7lpp2 0基因进行克隆和测序 ;通过对 7株Hplpp2 0基因的核苷酸序列及相应的氨基酸序列进行同源性分析 ,确定Hplpp2 0基因的变异性。采用由本研究室从郑州当地慢性萎缩性胃炎患者体内分离的HpMEL HP2 7菌株 ,应用自行设计的PCR引物 :上游 5′ GCCGAATTCATGAAAAATCAAGTTA 3′(EcoRⅠ ) ,下游 5′ GCCGTCGACCTA…     

幽门螺杆菌flaA基因在大肠杆菌中的表达与鉴定

目的：观察幽门螺杆菌(H．pylori)flaA基因在大肠杆菌中的表达。方法：用PCR方法扩增flaA基因,然后插入原核表达载体pMAL-c2x进行融合表达。采用蛋白印迹法对表达产物进行鉴定。结果：特异PCR和酶切鉴定证实flaA基因克隆入表达载体,并以融合蛋门形式MBP-FLA高效表达,约占细胞总蛋白的28％。该融合蛋白可与H.pylori阳性病人血清和小鼠H.pylori全菌抗体发生特异反应。结论：成功构建了能高效表达H．pylori FlaA蛋白的重组质粒,为H．pylori多价基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

幽门螺杆菌黏附素HpaA蛋白在大肠杆菌中表达及其免疫保护作用

目的表达和纯化幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)黏附素HpaA蛋白,研究其免疫活性和对小鼠的免疫保护作用。方法诱导TB1(pMAL-c2X-hpaA)表达H.pylori黏附素HpaA蛋白,Amyloss树脂预装柱进行分离、纯化,Western blot鉴定其免疫学活性;纯化蛋白免疫小鼠后,H.pylori国际标准菌株NCTC11637攻击感染,观察H.pylori定植情况及免疫保护效果。结果获得了高纯度且免疫活性良好的目的蛋白;HpaA蛋白免疫小鼠的保护率为53.33%(8/15),与对照组统计学差异显著(P=0.002)。结论纯化HpaA蛋白对小鼠有免疫保护作用,可作为H.pylori基因工程疫苗的候选组分。     

肺癌组织中蛋白质组双向电泳图谱分析方法的建立

目的：建立一套双向凝胶电泳图像的分析方法,为进一步分析和鉴定差异蛋白奠定基础。方法：提取肺癌组织和癌旁组织中的可溶性总蛋白,进行双向凝胶电泳,电泳图片由专用扫描仪获取后,应用图像分析软件(PDQuest 7.1)进行蛋白差异点的表达情况分析。结果：二维电泳图片经过背景消减、点检测、点匹配等一系列分析后,得出了差异点。结论：PDQuest 7．1软件可以用来快速有效地对生物样品之间蛋白质的差异进行分析。     

幽门螺杆菌外膜蛋白omp22和黏附素hpaA融合基因原核表达系统的构建与鉴定

目的:构建表达幽门螺杆菌(Hp)的外膜蛋白omp22和黏附素hpaA融合基因的重组蛋白质候选菌株,为Hp疫苗研究提供依据. 方法:用PCR方法扩增出带3个甘氨酸残基柔韧接头的融合基因omp22-hpaA, 将其克隆到表达载体pMAL-c2X中转化大肠杆菌(E.coli TB1),用IPTG诱导目的基因表达,SDS-PAGE方法对表达产物进行分析,Western Blot鉴定其免疫原性. 结果:测序结果显示, omp22-hpaA融合基因片段由1326 bp组成,为编码440个氨基酸残基的多肽,接头序列GGTGGAGGC已成功地插入omp22-hpaA融合基因中;SDS-PAGE结果显示表达产物相对分子质量约为53 ku,融合蛋白的表达量约占全菌总蛋白的20%. 结论:成功克隆并构建了omp22-hpaA融合基因原核表达系统.     

幽门螺杆菌融合蛋白HspA-UreB在大肠杆菌中的温控表达及其免疫反应性检测

目的：在温控表达载体pBV220中实现幽门螺杆菌(H．pylori)融合蛋白HspA-UreB的表达,并研究其免疫反应性。方法：含重组表达质粒pBV-HU27的人肠杆菌DH5α经30℃增菌后,存42℃下诱导表达,SDS-PAGE分析融合蛋白表达含量,与H．pylori全菌免疫小鼠血清和H．pylori感染患者血清进行Western blot分析,检测融合蛋白的免疫反应性。结果：SDS-PAGE分析结果显示存76500处出现特异蛋白带,诱导4h即可达到最高量,融合蛋白HspA-UreB占全菌蛋白含量的10％,该融合蛋白可以被H．pylori免疫小鼠血清和H．pylori阳性患者血清中的相应抗体所识别。结论：H．pylori融合蛋白HspA-UreB可以在温控表达载体中正确表达,且具有良好的免疫反应性。     

幽门螺杆菌脂蛋白基因的克隆和生物信息学分析

目的完成幽门螺杆菌(Hp)郑州分离株MEL-HP27脂蛋白(lipoprotein)基因lpp20的克隆和测序;分析该基因序列的变异性和表达蛋白的化学及免疫学特征,为Hp疫苗抗原的筛选奠定基础。方法用PCR方法从MEL-HP27的染色体DNA中扩增lpp20基因片段,将其与载体pNEB193连接后,用于转化大肠杆菌JM109,通过酶切和测序鉴定重组质粒。应用生物信息学软件Omiga2.0、GeneDoc2.3和GenBank、Swiss-port数据库对7个Hp菌株(MEL-HP27、60190、Chongqing、CH-CTX1、J99、17874、26695)的lpp20基因序列进行同源性比较,并对该基因编码蛋白的主要化学特征和抗原结构域进行分析。结果Hplpp20基因的核苷酸序列长度为528bp,不同菌株间的同源性为96.0%~98.1%。lpp20基因编码的氨基酸序列长度为175aa,不同菌株间的同源性为98.3%~100%。MEL-HP27lpp20表达蛋白的分子量为19.122kDa,等电点为9.950,具有2个抗原性结构域。结论Hplpp20基因的核苷酸序列和对应的氨基酸序列均具有较高的保守性,但保守性低于100%,采用该基因表达蛋白作为疫苗和诊断抗原时,有必要考虑人群感染的优势菌株的遗传特征,以提高免疫保护的覆盖率和免疫诊断的敏感性。Hplpp20基因编码的蛋白具有典型抗原分子的结构特征,有望成为Hp疫苗候选抗原。     

霍乱弧菌O139和El Tor菌株毒力岛区域分子特征比较

目的:比较O139霍乱弧菌(VC O139)菌株MO45基因组与O1群El Tor霍乱弧菌(EVC)菌株N16961基因组中毒力岛(VPI)区域分子特征.方法:制备霍乱弧菌VPI上游VC0815基因探针.从VC O139菌株MO45基因组文库中筛选一个既含有VC0815基因又含有tcpA基因的克隆,命名为pCOSVC081545,绘制pCOSVC081545 VPI上游片段的限制性酶切图谱,并与N16961同段序列的限制性酶切图谱进行比较.结果与结论:pCOSVC081545和N16961中VPI上游约1 500 bp片段的限制性酶切图谱基本相同,支持O139霍乱弧菌是EVC O抗原突变而来的观点.     

乳酸菌中幽门螺杆菌ureB基因的食品级表达与优化

目的:以乳酸乳球菌(Lactococcus lactis,L.lactis)为宿主菌构建幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)尿素酶B(UreB)的食品级表达系统.方法:从重组质粒pMD19-T-ureB上酶切得到ureB基因片段,与含有筛选标记lacF基因的L.lactis表达载体pN...     

氟对大鼠睾丸生殖细胞增殖细胞核抗原表达的影响

目的了解氟对大鼠睾丸生殖细胞增殖功能的影响。方法对雄性大鼠腹腔注射NaF溶液建立氟中毒模型,观察睾丸的病理学、生殖细胞数量及生精功能的改变,免疫组化法测定睾丸生殖细胞中增殖细胞核抗原(PCNA)的表达。结果高剂量染毒组(20mg/kg)与低剂量染毒组(10mg/kg)大鼠的睾丸生殖细胞数分别为(161.00±16.16)和(268.00±12.13),低于对照组(P<0.05),其生殖细胞PCNA表达率分别为(0.60±0.81)%和(0.71±0.05)%,亦低于对照组(P<0.05);其精子数目、精子活动度比对照组显著降低(P<0.05),精子畸形率比对照组显著升高(P<0.05)。结论氟可能通过抑制PCNA的表达,从而减少生殖细胞的数量,对雄性生殖系统造成损害。