幽门螺杆菌分离株iceA基因克隆及序列分析

目的 克隆幽门螺杆菌中国郑州市慢性萎缩性胃炎患者分离株MEL-Hp27 iceA基因,测序后对其进行序列分析.方法 根据iceA基因上下游基因序列设计引物,PCR扩增iceA基因,并将其连接至pMD19-T载体,测序后采用相关数据库和生物信息学软件对基因序列进行分析.结果 成功克隆幽门螺杆菌Hp27菌株iceA基因序列,扩增产物大小约为790 bp;重组质粒pMD19-T-iceA单酶切产生3 820 bp片段,双酶切产生3 000和820 bp的2个片段;Hp27iceA基因与大多数美国来源菌株同源性＞85%,与日本、印度等地区来源菌株同源性＜70%.序列分析结果表明,所克隆到的基因为iceA2亚型,与美国株Alaska strain 219、Alaska strain 213关系最近,同源性分别为87%和95%,与芬兰株Finland strain 9496等菌株存在聚类关系,同源性88%～93%,与CR9等其他菌株距离较远.结论 成功克隆幽门螺杆菌Hp27菌株iceA基因序列;不同地区幽门螺杆菌分离株的iceA基因间存在着一定差异.     

幽门螺杆菌omp22基因工程菌蛋白表达条件优化、纯化及活性鉴定

[目的]优化幽门螺杆菌omp22基因工程菌(pMAL-c2X-omp22-TB1)的表达条件,并对目的蛋白进行纯化和免疫活性鉴定. [方法]在不同诱导时机、诱导剂(IPTG)浓度、诱导时间下诱导pMAL-c2X-omp22-TB1的表达,测定目的蛋白的表达量.在优化条件下诱导工程菌表达,采用SDS-PAGE方法对表达产物分析;Amyloss树脂预装柱对可溶性OMP22蛋白进行分离、纯化,对纯化蛋白做Westem blot分析. [结果]工程菌培养2 h时加入IPTG(终浓度为0.3mmol/L)诱导4 h,目的蛋白表达量达到菌体总蛋白的25%以上;经纯化得到了较高纯度(>90%)的目的蛋白,并具有良好的免疫原性. [结论]建立了从TB1(pMAL-c2X-omp22)可溶性表达产物中纯化较高纯度OMP22融合蛋白的方法,为进一步的动物实验和诊断性抗原的研制以及工程菌高效表达生产工艺的研究打下了基础.     

幽门螺杆菌ureB在乳酸菌中的表达和抗原活性鉴定

在幽门螺杆菌疫苗研究中,尿素酶(Ure)是研究最多、最理想的疫苗候选抗原.目前研究常以减毒沙门菌作为活菌载体,但活的减毒沙门菌在人体及动物体内仍有一定的毒性,而不能用于体质弱的群体如婴幼儿、年老者及免疫缺陷者.以乳酸乳球菌(Lactococcus Lactis,L. lactis)作为活菌疫苗载体,可以避免上述问题.L. lactis已经广泛用于食品工业,被公认为是安全的食品级微生物.作为异源蛋白和酶的输送载体,特别是L. lactis食品级高效表达系统的构建及应用己成为该领域研究的前沿和热点.     

Survivin特异性siRNA真核表达载体的构建

目的构建Survivin特异性siRNA真核表达载体，为以Survivin基因为靶点、小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）为手段的白血病和其它恶性肿瘤基因治疗的基础和临床应用提供良好的技术手段。方法根据GeneBank数据库提供的Survivin基因所有变异体的共同核苷酸序列，按照Tuschl设计原则，选择设计双链siRNA，再转化为能表达其小发卡结构RNA（small hairpin RNA，shRNA）的DNA序列，并与载体pSINsi-hU6定向连接，构建受控于启动子u6的真核表达载体pSIN／shRNA1、pSIN／shR-NA2，经限制性内切酶酶切和DNA测序进行鉴定。结果构建Survivin特异性siRNA真核表达载体pSIN／shRNA1、pSIN／shRNA2，经限制性内切酶酶切和DNA测序证实与设计完全一致。结论Survivin特异性siRNA真核表达载体构建成功。     

热休克蛋白70双向免疫印记鉴定及抗体制备

目的验证肺癌组织中热休克蛋白70（HSP 70）表达量,从肺癌组织中获得HSP 70并初步制备其人源性抗体,为进一步研究其生物功能和临床应用奠定基础。方法收集肺癌组织和癌旁组织标本,应用双向电泳-免疫印记方法验证HSP 70的表达量,经过亲和层析和离子交换层析方法获得肺癌组织中HSP 70作为抗原,经过四轮亲和-吸附-洗脱,从人源性肺癌噬菌体单链抗体库中初步筛选其抗体。结果双向电泳-免疫印记结果表明,肺癌组织HSP 70表达量高于癌旁组织。凝胶电泳和免疫印记结果表明,从肺癌组织中获得了人源性HSP 70,以此HSP 70作为抗原,初步筛选出了其抗体。结论人源性HSP 70及其人源性特异结合抗体的获得,为进一步研究其抗肺癌的临床应用提供了基础依据。     

人源性肺癌噬菌体展示单链抗体库的构建

目的:构建人源性肺癌噬菌体单链抗体库,为筛选肺癌相关抗原的抗体奠定基础。方法:提取肺癌转移淋巴结总RNA,用RT-PCR技术扩增人抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因,在体外将VH和VL连接成单链抗体(ScFv)基因,并克隆到噬菌粒载体pCANTAB 5E中,电转化至感受态的大肠杆菌TG1,经辅助噬菌体超感染,形成噬菌体单链抗体库,采用限制性内切酶鉴定其多样性。结果:从肺癌转移淋巴结中成功提取RNA,逆转录PCR扩增出人可变区基因,连接形成单链抗体,最终构建了库容为1.2×108的抗人肺癌单链抗体库。BstNⅠ酶切法证明构建的抗体库具有良好的多样性。结论:成功地构建了噬菌体展示的抗人肺癌单链抗体库,为进一步筛选肺癌相关蛋白的可溶性抗体奠定了基础。     

幽门螺杆菌感染的昆明小鼠模型的建立

幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）是全球人群感染率最高的一种革兰阴性致病菌。Hp感染与人体胃炎、胃溃疡、胃癌等疾病的发生密切相关，根除Hp感染可以降低胃癌的发病率。Hp感染的动物模型是研究Hp疫苗的重要工具，但现有的动物模型都存在较大的缺陷，因此，仍有必要对Hp感染动物模型进行研究。清洁级中国昆明小鼠具有价廉、易于饲养、繁殖、生存环境与人类相对接近等优点，但目前其在Hp动物模型方面的应用尚少见报道。     

空气中化学耗氧量测定法

用化学耗氧量作为评价室内空气污染的综合指标,已受到许多学者的重视。由于空气中还原物质成份复杂,采样技术成为建立空气化学耗氧量测定方法的关键,但目前,报道尚不多见。作者采用低温冷阱捕集和硫酸—重铬酸钾(K_2Cr_2O_7—H_2S为_4)吸收相结合的方法采样,测定空气化学耗氧量,获得了较好的效果。     

氯沙坦抑制糖基化终末产物刺激培养的人内皮细胞外基质基因的表达

目的　探讨氯沙坦防治糖尿病血管病变的作用机理。方法　用反转录 聚合酶链反应 (RT PCR)和Northern印迹杂交方法测定了 0 .1～ 10 μmol·L- 1浓度的氯沙坦对经体外制备的糖基化终末代谢产物(AGEs)处理培养的人脐静脉内皮细胞 (HUVECs)转化生长因子 (TGF) β1和纤连蛋白 (FN)基因表达的影响。结果　由AGEs处理的HUVECsTGF β1和FNmRNA表达较正常对照组明显增高 ;与AGEs组相比 ,TGF β1和FNmRNA的表达在氯沙坦 1.0 μmol·L- 1时分别降低了 2 9%和 2 3%,10 μmol·L- 1时降低了 5 6 %和 6 2 %。结论　氯沙坦通过抑制AGEs刺激的内皮细胞TGF β1和FNmRNA表达 ,从而抑制细胞外基质的生成 ,防止血管重构可能是其防治糖尿病血管并发病的机理之一。     

幽门螺杆菌lpp20基因的克隆及序列分析

幽门螺杆菌 (Hp)lpp2 0基因编码Hp外膜上的一种相对分子质量约为 18× 10 3的脂蛋白 (Lpp2 0 )。有研究表明 ,Lpp2 0具有良好的免疫原性和免疫保护性 ,是一种理想的疫苗候选抗原。本研究对Hp郑州分离株MEL HP2 7lpp2 0基因进行克隆和测序 ;通过对 7株Hplpp2 0基因的核苷酸序列及相应的氨基酸序列进行同源性分析 ,确定Hplpp2 0基因的变异性。采用由本研究室从郑州当地慢性萎缩性胃炎患者体内分离的HpMEL HP2 7菌株 ,应用自行设计的PCR引物 :上游 5′ GCCGAATTCATGAAAAATCAAGTTA 3′(EcoRⅠ ) ,下游 5′ GCCGTCGACCTA…