pMAL-C2融合表达幽门螺杆菌HspA-UreB重组蛋白

幽门螺杆菌 (Hp)有效保护性抗原有多种 ,如 :热休克蛋白 (Hsp)、尿素酶 (Ure)、空泡毒素 (VacA)、毒素相关蛋白(CagA) 及过氧化氢酶等 ,但单独免疫动物时保护性均不理想 ,而使用多种抗原成分联合免疫 ,可使 10 0 %的小鼠避免感染Hp[1] 。本研究将Hp的两个主要抗原成分HspA和UreB的编码基因共同插入一个融合表达载体 pMAL C2 ,使其融合表达 ,为Hp基因重组疫苗的研究奠定基础。一、材料与方法1.质粒与菌株 :克隆质粒 pNEB193和融合表达载体pMAL C2购自NEB公司。大肠杆菌JM10 9系本研究室保存。Hp国际标准菌株NCTC116 37系张建中…     

O139群霍乱弧菌毒力岛区域分子特征分析

目的 比较O139群霍乱弧菌国际标准株M045和O1群E1 Tor型霍乱弧菌国际标准株N16961基因组中毒力岛区域分子特征.方法 从MO45基因组中筛选含有毒力岛上游的VC0815基因及其上游基因片段并克隆到pNEB193中命名为pNEBVC081545,绘制pNEBVC081545的限制性酶切图谱并与N16961同段序列限制性酶切图谱进行比较.在pNEBVC081545中选择VC0815基因上游的一段侧序列进行亚克隆,测序后与N16961同段序列比较.结果 pNEBVC081545限制性酶切图谱中VC0815基因上游序列图谱中第1个碱基位置是限制性内切酶位点为KpnⅠ,第732位为Sal Ⅰ,第819位为Hpa Ⅰ,第1578位为Bgl Ⅱ,第1600位为Hind Ⅱ,第1943位为Xba Ⅰ,第3247位为EcoR Ⅰ,此段序列限制性内切酶图谱与N16961同段序列限制性酶切图谱完全相同.对Sal Ⅰ和EcoR Ⅰ之间的序列进行亚克隆,并对该段序列测序,测序结果表明该段核酸序列与N16961中同段序列完全相同.结论 O139霍乱弧菌可能是E1 Tor霍乱弧菌O抗原突变而产生的菌群.     

染氟大鼠生精细胞凋亡和血清雌二醇水平的关系

目的探讨染氟大鼠生精细胞凋亡和血清雌二醇水平的关系。方法雄性Wistar大鼠30只,随机分为6组,即对照28d组、低剂量染毒28d组、高剂量染毒28d组、对照38d组、低剂量染毒38d组和高剂量染毒38d组。通过腹腔注射NaF溶液的方法建立氟中毒模型,采用酸浸-氟离子选择电极法测定睾丸氟含量,放射免疫的方法检测血清雌二醇水平,采用TUNEL方法检测凋亡的生精细胞。结果随着染毒剂量加大和时间延长,染氟大鼠血清雌二醇水平显著下降(P<005),睾丸氟含量显著升高(P<005),生精细胞凋亡率显著升高(P<005),且血清雌二醇水平与睾丸氟含量和生精细胞凋亡率均呈负相关(P<005)。结论氟在一定剂量和作用时间内可致血清雌二醇水平紊乱,是导致生精细胞凋亡的重要原因之一。     

幽门螺杆菌Omp11重组蛋白的制备和应用

幽门螺杆菌（Hp）感染与人体胃炎、消化性溃疡、胃癌等疾病的发生密切相关，免疫接种是控制Hp感染流行最有效的措施，但由于Hp感染的免疫机制比较复杂，尚未发现一种效果理想的疫苗抗原。Hp外膜作为免疫攻击的重要靶标在人体保护性免疫反应中具有重要的作用。Omp11是Hp的一种外膜蛋白，其编码基因具有高度的保守性，有望成为疫苗抗原，但目前国内外均未检索到关于Omp11抗原活性和免疫效果的报道。因此，拟应用基因克隆方法研究Omp11重组蛋白（rOmp11）的制备、抗原活性和应用价值。     

幽门螺杆菌中性白细胞激活蛋白基因napA克隆及序列分析

目的：从幽门螺杆菌(H．pylori)中克隆中性白细胞激活蛋白基因napA并构建重组载体。方法：提取H．pylori郑州分离株MEL-HP27基因组DNA作模板;根据H．pylori J99全基因组序列设计napA PCR引物,高保真酶扩增napA片断;限制性内切酶切PCR产物和pNEB193空质粒,T4 DNA酶连接酶切产物,重组质粒转化E．coli TBIT程菌,蓝白斑试验筛选阳性克隆;提取质粒经酶切鉴定后测序并利用生物学软件进行序列分析。结果：DNA限制性内切酶可从重组质粒pNEB-napA的EcoR I和Sal I位点之间切出一个435bp的DNA片断,测序结果与J99 napA同源性为96．5％,与H．pylori其他菌株的同源性为92％～97％。结论：成功构建H．pylori中性白细胞激活蛋白基因的重组质粒pNEB-napA;序列分析表明HP-napA是一类高度保守的原核型基因,可作为H．pylori疫苗候选基因。     

幽门螺杆菌中性白细胞激活蛋白与麦芽糖结合蛋白融合表达产物rMBP-NAP的分离纯化

目的：从E．coli TB1(pMAL-c2x-napA)细菌中分离纯化与麦芽糖结合蛋白融合表达的重组幽门螺杆菌中性白细胞激活蛋白rMBP-NAP,筛选幽门螺杆菌口服疫苗抗原组分。方法：0．3mmol／L IPTG在37℃,230r／min条件下诱导基因丁程菌E．coli TB1(pMAL-c2x-napA)3h。4℃ 4000g离心20min收获细胞。过柱缓冲液重悬细胞,一20℃冻仔过夜,在冰水浴中超卢破碎工程菌,4℃,9000g离心30min,十二烷基磺酸钠-聚炳烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析工程菌中rMBP-NAP可溶性;低相对分子质量蛋白Marker做标准对照,GeneTool测定诱导蛋白相对分子质量。FPLC分子排阻层析法分离rMBP-NAP;SDS-PAGE凝胶扫描法测纯化蛋白质的纯度,Bradford法检测蛋白质含量。结果：E．coli TB1(pMAL-c2x-napA)诱导表达的rMBP-NAP主要以可溶性形式存在于超声上清中,占上清中蛋白总量的39．35％,相对分子质量约为57000,与预期结果一致;分子大小排阻层析一步法纯化rMBP-NAP纯度可达91％,含量可达0.121g/L。结论：FPLC分子排阻层析可从大肠丁程菌超声菌液巾快速纯化rMBP-NAP。     

幽门螺杆菌16SrDNA指纹图和PCR-RFLP基因分型研究

目的　探讨我国幽门螺杆菌 (Helicobacterpylori,Hp)的基因多态性及其与相关疾病之间的关系。 方法　应用PCR掺入法制备 16SrRNA基因探针 ,建立 16SrDNA指纹图技术和尿素酶C(ureC)基因的PCR -RFLP法 ,并结合统计学软件进行聚类分析 ,对临床分离的 14株Hp进行基因分型。结果　 14株Hp的 16SrDNA指纹图谱显示 10个HaeⅢ杂交带型和 12个HindⅢ杂交带型 ;ureC基因的变异度较小 ,14株Hp中有 12株PCR -RFLP图谱完全一致。通过杂交结果示意图和SPSS10 0软件进行聚类分析 ,HaeⅢ、HindⅢ及两种酶杂交结果的综合 ,均将 14株Hp分为两型。两种方法结果综合进行聚类分析 ,14株Hp在基因水平上分为三型。结论　差异显著的DNA指纹图谱说明了不同Hp菌株间基因组结构的高度变异性。 16SrDNA指纹图谱较ureC基因的PCR -RFLP谱型更敏感地表达Hp各菌株的变异 ,可准确有效地对Hp作出基因分型。未发现Hp菌株间有特异的疾病图谱存在     

邻苯二甲酸酯类物质对蚕豆根尖细胞微核率的影响

目的： 研究几种邻苯二甲酸酯类物质的遗传毒性。方法：用不同浓度邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丙酯、邻苯二甲酸二丁酯和邻苯二甲酸二 (2-乙基己基)酯对蚕豆根尖染毒24 h后,观察蚕豆根尖细胞的微核数。结果：邻苯二甲酸二甲酯在浓度为0.008、0.016和0.032 mg/L,邻苯二甲酸二丁酯和邻苯二甲酸二 (2-乙基己基)酯在浓度为0.016和0.032 mg/L时,所致蚕豆根尖细胞微核率均显著高于阴性对照组 (P<0.05)。邻苯二甲酸二乙酯和邻苯二甲酸二丙酯染毒后的蚕豆根尖细胞微核率与阴性对照组比较差异无统计学意义 (P>0.05)。结论：在本实验条件下,邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二 (2-乙基己基)酯对蚕豆根尖具有遗传毒性,低浓度邻苯二甲酸二乙酯和邻苯二甲酸二丙酯对蚕豆根尖不具有遗传毒性。     

三株霍乱弧菌16s rDNA指纹图谱分析

目的探讨我国新疆分离O139群霍乱弧菌的基因组特征。方法自行设计引物，利用PCR掺人法用地高辛标记的16srDNA基因探针，分别对二株VCO139霍乱弧菌(新疆分离株XJ93006、国际标准株M045)及一株El Tor菌株(新疆分离株89079)的基因组DNA的Bgl I、Pvu I酶切产物进行southem杂交。结果杂交结果显示此三株霍乱的杂交图谱均不同。结论我国新疆的O139霍乱既不同于本地的El Tor霍乱，也与国际标准株存在差异。