幽门螺杆菌融合蛋白HspA-UreB在pMAL-C2x中的表达与免疫学活性研究

目的:在pMAL-C2x中表达幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)融合蛋白HspA-UreB,探索其免疫学活性,为Hp基因工程疫苗的研究奠定基础。方法:从重组质粒pNHA27和pNUB27中纯化回收hspA和ureB基因片段,并以hspA-ureB的顺序连接后插入原核表达载体pMAL-C2x中,表达麦芽糖结合蛋白(MBP)与HspA-UreB的融合蛋白。采用亲和层析法纯化融合蛋白MBP-HspA-UreB,并辅以弗氏佐剂皮下免疫小鼠,蛋白印迹法对免疫小鼠血清进行检测。结果:特异PCR法和酶切鉴定证实融合基因hspA-ureB克隆入表达载体,并以融合蛋白形式MBP-HspA-UreB高效表达,相对分子量为119 000,约占细胞总蛋白的31%。通过大肠杆菌抗原吸收法纯化免疫小鼠血清后,与纯化的融合蛋白进行杂交,结果显示在119 000处出现特异杂交带。结论:融合蛋白HspA-UreB具有良好的免疫原性和免疫反应性。     

霍乱弧菌O139和El Tor菌株tcpA分子特征的研究

[目的]从霍乱弧菌XJ93006、MO45、XJ89079中克隆毒素协同调节菌毛亚单位A（tcpA）基因（包括侧序列）并测序比较。[方法]PCR扩增tcpA片段;克隆该片段;提取质粒经鉴定后测序并利用DNAMAN对该序列进行序列分析,比较。[结果]成功构建XJ93006、MO45、XJ89079 tcpA基因的重组质粒。三株霍乱弧菌及与N16961 tcpA基因及其两侧核酸序列同源性XJ89079和N16961为100%,XJ93006和XJ89079为99.8%,XJ93006和MO45为99.5%,XJ89079和MO45为99.7%。[结论]该研究初步认为我国新疆VC O139与本地EVC关系密切。     

利用生物信息学分析幽门螺杆菌Lpp20蛋的化学和免疫学分子特征

目的分析幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,Hp)郑州分离株MEL-HP27Lpp20蛋白的主要化学和免疫学分子特征,为Hp基因工程疫苗和诊断抗原的研究奠定基础。方法根据本研究室克隆的HpMEL-HP27lpp20基因的核苷酸序列推导出该基因表达产物(Lpp20)的氨基酸序列,应用生物信息学软件Omiga2.0、Anthepro4.5和GenBank数据库对Lpp20分子的主要化学特征和抗原活性进行分析。结果MEL-HP27Lpp20蛋白的氨基酸序列长度为175aa,Lpp20蛋白的分子量为19.122kDa,等电点为9.950,pH7.0时带电荷为9.035,280nm摩尔消光系数为12210,280nm吸光度为0.639,具有2个有抗原活性的结构域。结论MEL-HP27Lpp20蛋白分子具有典型抗原分子的结构特征,有希望成为新的Hp疫苗候选抗原。     

志贺菌耐多药外排泵emrE基因作用分析

目的 对临床耐多药志贺菌株H24的1种小多重耐药性家族(SMR)外排泵emrE基因进行定向分子进化,研究基因突变增强emrE外排泵耐药性的潜力,调查志贺菌外排泵基因emrE基因垂直进化对临床耐药发展的影响.方法 通过用体外易错PCR(EP-PCR)方法对emrE基因进行随机突变实验,用微量稀释生长曲线法进行菌株的耐药性筛选,用荧光实时定量RT-PCR测定基因表达情况,应用DNA分析软件DNAStar进行生物信息学分析.结果 在31个突变子中筛选到了突变子ep2-emrE(DH5α),它的emrE基因有6个氨基酸突变,分别为Thr-28→Ala,Cys-39→Ser,Tyr-40→终止子,Ser-72→Arg,Leu-93→Phe,lie-101→Phe.它不但增强四环素和红霉素的耐药能力,还产生新的氯霉素耐药能力.结论 尽管emrE基因较易获得新增耐药性,但在志贺菌对四环素、红霉素等抗生素耐药性发展中,emrE基因的进化突变没有被筛选,表明有其他能力更强的耐药基因在突变进化中起作用.     

氯沙坦抑制糖基化终末产物刺激培养的人内皮细胞外基质基因的表达

目的 探讨氯沙坦防治糖尿病血管病变的作用机理。方法 用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Northern印迹杂交方法测定了0.1～10 μmol·L^-1浓度的氯沙坦对经体外制备的糖基化终末代谢产物（AGEs）处理培养的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）转化生长因子（TGF）-β₁和纤连蛋白（FN）基因表达的影响。结果 由AGEs处理的HUVECs TGF-β₁和FN mRNA表达较正常对照组明显增高；与AGEs组相比，TGF-β₁和FN mRNA的表达在氯沙坦1.0 μmol·L^-1时分别降低了29%和23%，10 μmol·L^-1时降低了56%和62%。结论 氯沙坦通过抑制AGEs刺激的内皮细胞TGF-β₁和FN mRNA表达，从而抑制细胞外基质的生成，防止血管重构可能是其防治糖尿病血管并发病的机理之一。     

环境中铬污染对人体免疫功能的影响

用琼脂平板法和单向免疫扩散法分别测定唾液溶菌酶和唾液IgG、IgA;用1%重铬酸钾溶液作皮肤斑贴试验;用分光光度法测尿铬。结果:直接接触组唾液溶菌酶含量明显低于经口摄入组及对照组(P<0.01);而唾液IgG、IgA均明显高于后两组(P<0.01);皮肤斑贴试验阳性率亦明显高于后两组(P<0.05,P<0.01);直接接触组和经口摄入组尿铬水平均明显高于对照组(P<0.01)。结果提示:铬经呼吸道进入可影响机体免疫功能,但经消化道长期低剂量摄入对人体免疫功能影响不大。     

水中微量苯并(a)芘富集方法的改进

水中的多环芳烃的代表物苯并(a)芘(Bap)由于含量甚微,通常在10~(-12)级以下,现有分析仪器不能直接检出.故对水样进行预浓缩是BaP分析中的关键问题。目前常用的浓缩方法有聚氨脂泡沫法和溶剂淬取法,前者富集的最佳条件在60℃,且富集后洗脱困难;后者不但需要大量溶剂,时间长,而且浓缩倍数有限,难以适应清洁地面水和地下水中BaP的分析。为此我们改用XAD-2树脂富集水中BaP,获得了     

蟒河沿岸居民健康状况的调查

采用环境流行病学调查方法，以污染严重的黄河支流蟒河沿岸居民作为研究对象，以蟒河武陟段为污染区及与之相距１０ｋｍ的９个村庄为对照区对居民健康进行了调查研究。该研究结果显示，蟒河的污染造成了沿岸居民健康损害。     

幽门螺杆菌lpp20基因与麦芽糖结合蛋白基因的融合表达与纯化

目的 研究幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，H．pylori)lpp20基因与麦芽糖结合蛋白基因的融合表达产物的纯化方法，为幽门螺杆菌基因工程疫苗的制备建立基础。方法 采用本研究室分离的HpMEL-HP27菌株提取染色体DNA，用PCR方法从HP染色体DNA上扩增出lpp20基因片段，将目的基因插人到表达载体pMAL-c2X中，用重组质粒转化大肠杆菌(E．coil TB1)。采用IPTG进行诱导表达。用多糖树脂(amylose resin)作为填充料，制备层析柱，将可溶性菌体蛋白进行亲和层析。应用SDS-PAGE方法对纯化产物进行分析。结果 融合蛋白的分子量约为60kDa，融合蛋白的表达量约占全菌总蛋白的34％；纯化后的融合蛋白纯度达90％以上。结论 与麦芽糖结合蛋白基因融合的lpp20基因在E．coli TB1中能够高效表达；用多糖树脂作为填充料，进行亲和层析的方法，具有良好的纯化效果。     

霍乱弧菌毒素协同调节茵毛基因tcpA的克隆及序列分析

目的以新疆分离0139霍乱弧菌XJ93006株的DNA为模板，自行设计引物克隆毒素协同调节菌毛亚单位A(tcpA)基因(包括侧序列)并构建重组载体。方法以0139霍乱弧菌新疆分离株XJ93006基因组DNA作为模板；根据0l群ElTor型霍乱弧菌N16961全基因组序列设计tcpA PCR引物，高保真酶扩增tcpA片段：限制性内切酶切PCR产物和pNEB193空质粒，T4DNA连接酶连接酶切产物，重组质粒转化大肠什菌TB1工程菌，蓝白斑菌落试验筛选阳性克隆；提取质粒经酶切鉴定后测序并利用生物信息数据库对该序列进行序列分析，比较.结果DNA限制性内切酶可从重组质粒pNEB193-tcpA的EcoRI和Sal I位点之间切出一个1037bp的DNA片段，测序结果与01群ETTor型霍乱弧菌N16961、O139霍乱弧菌标准株M045的tcpA同源性均达到99.9％以上。结论成功构建0139霍乱弧菌新疆分离株XJ93006毒素协同调节菌毛亚单位A(tcpA)基因的重组质粒pNEB193-tcpA；序列分析表明霍乱弧菌毒素协同调节菌毛亚单位A(tcpA)基因住01群ETTor型霍乱弧菌和0139霍乱弧菌中是一类高度保守的原核基因，可作为霍乱弧菌疫苗的候选基因。另外为研究0139霍乱弧菌的来源奠定基础。