hoxb4转基因斑马鱼造血发育中rap1b基因的表达

目的 为了发现在早期造血发育中关键的调控因子,利用hoxb4转基因斑马鱼研究rap1b基因的表达变化情况,以期明确hoxb4与rap1b在早期造血发育中的关系.方法 选取过表达hoxb4的斑马鱼系为研究对象,分为3组:实验组(表达hoxb4-EGFP的斑马鱼),实验对照组(表达EGFP的斑马鱼),空白对照组(野生型斑马鱼).通过流式分选技术将实验对照组和实验组18hpf(斑马鱼胚胎受精发育18h)、24、30、36、48hpf胚胎中带有绿色荧光(enhanced green fluorescent protein,EGFP)信号的细胞分选出来,利用实时荧光定量PCR检测分选出的细胞中的rap1b基因的表达变化;然后收集野生型斑马鱼多时相胚胎,制备rap1b基因的反义mRNA探针,通过胚胎原位杂交观察探针在3组斑马鱼胚胎18、24、30、36、48hpf杂交信号表达部位.结果 qRT-PCR结果显示实验组30、36、48hpf的斑马鱼胚胎的rap1b基因的表达明显增强(P＜0.05);制备了rap1b基因的反义mRNA探针,胚胎整体原位杂交结果显示:rap1b基因在3组斑马鱼胚胎18 ～ 48 hpf之间神经发育和造血发育部位都有表达.结论 在过表达hoxb4转基因斑马鱼中rap1b基因表达有明显的升高趋势,提示rap1b基因与hoxb4基因可能共同参与调节早期造血发育过程.     

野生型斑马鱼胚胎中hoxd3基因mRNA的表达谱

目的:为探讨hoxd3基因在斑马鱼发育过程中与血管形成可能的作用机制,用hoxd3基因的反义mRNA探针进行斑马鱼全胚胎原位杂交,观测hoxd3基因在野生型斑马鱼胚胎发育过程中的表达情况。方法:提取斑马鱼胚胎总RNA,经RT-PCR扩增斑马鱼hoxd3基因片段,将得到的hoxd3基因片段和pCS2+质粒经EcoRⅠ、XbaⅠ双酶切后插入pCS2+质粒中,挑选阳性克隆,通过双酶切、菌落PCR以及测序鉴定;将pCS2+-hoxd3重组子经EcoRⅠ酶切线性化,经T3RNA体外转录体系合成地高辛标记的hoxd3基因的反义mRNA探针。用hoxd3基因的反义mRNA探针进行斑马鱼全胚胎原位杂交。结果:构建和鉴定了pCS2+-hoxd3重组质粒,经斑马鱼全胚胎原位杂交检测hoxd3基因的表达,发现在Tuebingen野生型斑马鱼受精后24 h～72 h胚胎的中脑后脑交界处以及后脑中可以观察到hoxd3基因的表达。结论:hoxd3基因在Tuebingen野生型斑马鱼胚胎发育早期的神经系统高表达,未发现在血管生成区域的表达。     

两株登革2型病毒E、NS1蛋白基因序列测定及其系统发生分析

目的 :对从登革出血热 (denguehemorrhagicfever ,DHF)病人血清分离到的一株登革 2型病毒 (denguevirustype 2 ,DEN 2B株 )和DEN 2NGC株作E、NS1蛋白部分基因序列测定并进行系统发生树分析 ,了解其变异及分子进化特证。方法 :利用RT PCR法扩增B株和NGC株E、NS1部分基因片段 ,PCR产物直接测序 ;利用DNAssist软件预测其氨基酸序列 ,以及PHYLIP软件的CLUSTAL方法绘制系统发生树。结果 :B株与NGC株E蛋白基因区第 1～ 4 76nt(4 76bp)碱基序列存在 8个位点的差异 ;编码氨基酸存在 4个位置的不同 ;NS1基因区第 5 89～ 1 0 0 …     

贵州自然界白纹伊蚊体内登划病毒带毒情况

目的 :利用细胞、分子生物学技术对贵州省自然界白纹伊蚊体内带登革病毒 (DEN)情况进行调查。方法 :采集贵州省9个地 (州 )市共计 18个县 (区 )白纹伊蚊幼虫标本 ,饲养为成蚊 ;制备蚊悬液 ,碘化钠法提取RNA ,用登革病毒NS1基因区通用引物经逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)检测DEN核酸 ,限制性内切酶酶切鉴定阳性PCR产物并分型 ;蚊悬液接种C6 /36细胞进行病毒分离 ,制作细胞片 ,间接免疫荧光法检测DEN抗原。结果 :从独山县麻尾镇白纹伊蚊标本中分离到 1株DEN 2型病毒 ,从凯里、黄果树和镇远 3处地方株白纹伊蚊体内检测出DEN核酸 ,用抗DEN 4型单克隆抗体经间接免疫荧光(IFA)和RT PCR产物酶切分型鉴定分别为登革病毒 2型、4型。结论 :贵州省存在DEN感染的自然循环     

骨髓间充质干细胞对大鼠佐剂性关节炎防治的实验研究

目的探讨骨髓间充质干细胞(MSCs)对大鼠佐剂性关节炎(AA)的治疗、干预作用。方法收集培养扩增SD大鼠骨髓MSCs。SD大鼠注射弗氏完全佐剂造模之后行MSCs治疗及干预。造模后定期测量大鼠体质量、踝关节周长和后足爪体积。治疗后第21天,行四肢关节X线片及病理检查。结果模型大鼠经MSCs治疗后关节肿胀减轻,X线片示骨质破坏明显修复。病理HE染色见关节滑膜病变减轻。干预组经MSCs治疗,原发性炎症和继发病变均不明显,关节X线片和病理检查均未见明显异常,与模型组大鼠相比,体质量、足爪体积以及踝关节周长差异有统计学意义(P<0.05)。结论 MSCs治疗可有效减轻并逆转弗氏完全佐剂诱导的大鼠AA的进展。     

疱疹病毒经胎盘传播的研究

应用ＰＣＲ技术和ＥＬＩＳＡ间接法对贵阳地区２８６对母婴配对血清进行巨细胞病毒（ＣＭＶ）和单纯疹病毒（ＨＳＶ）ＤＮＡ和特异性ＩｇＭ、ＩｇＭ抗体检测。结果表明贵阳地区产妇ＣＭＶ、ＨＳＶ特异性ＩｇＧ抗体阳性率分别为８５．６７％和８０．７７％;新生儿血清ＣＭＶ、ＨＳＶ特异性ＩｇＧ抗体阳性率为８２．８７％和７６．９２％。而产妇血清ＣＭＶ、ＨＳＶ１,２ＤＮＡ检出率分别为１２．２４％、９．７９％和６．２９％;新     

泼尼松制剂对小鼠免疫功能的影响

目的了解不同剂量的泼尼松制剂对小鼠特异性和非特异性免疫功能的影响。方法以肌肉注射0.25 mL/kg、0.124 8 mL/kg、0.05 mL/kg的用药量将小鼠分为高、中、低剂量组,同时设一对照组,连续用药10 d,分别检测各组小鼠的体质量、胸腺指数、脾脏指数、巨噬细胞的吞噬率、中性粒细胞的吞噬率、T淋巴细胞E花环率、溶血素效价和抗绵羊红细胞抗体形成细胞的水平。结果高剂量组与对照组相比,除巨噬细胞的吞噬率、T淋巴细胞E花环率、胸腺指数无显著性差异外,其余各项指标都有显著性差异;中剂量组、低剂量组与对照组相比,体质量、胸腺指数、脾脏指数、中性粒细胞吞噬率、溶血素效价有显著性差异,其余各项指标无显著性差异。结论高剂量的泼尼松制剂对体质量、脾脏质量、中性粒细胞吞噬功能、B淋巴细胞分泌抗体的能力、抗绵羊红细胞抗体形成细胞的水平有抑制作用。中、低剂量的泼尼松对体质量、脾脏质量、胸腺质量、中性粒细胞吞噬功能、B淋巴细胞分泌抗体的能力有抑制作用。     

人脐带间充质干细胞过敏性试验

目的：观察人脐带间充质干细胞对豚鼠的过敏性反应,为临床使用人脐带间充质干细胞的安全性提供参考。方法：培养扩增人脐带来源的间充质干细胞,制备成细胞生理盐水混悬液。将30只豚鼠分成3组,分别是模型1组、模型2组和对照组。2个模型组隔日肌注细胞生理盐水混悬液3次,实验1组于首次注射后第14天,实验2组于首次注射后第21天分别静脉注射混悬液进行攻击。观察动物有无过敏反应症状。结果：动物无明显过敏反应症状,反应级数为0级。结论：人脐带间充质干细胞免疫原性低,不易导致过敏反应。     

CRISPR/Cas9技术敲除斑马鱼rpl15基因对斑马鱼红系造血发育的影响

目的 利用CRISPR/Cas9技术敲除斑马鱼rpl15基因,探讨rpl15基因对斑马鱼红系造血发育的影响.方法 针对斑马鱼rpl15基因设计并制备gRNA(guide RNA),将gRNA与Cas9蛋白的混合物显微注射到单细胞期斑马鱼受精卵中,提取72 h胚胎基因组DNA,PCR扩增出目的片段,T7E1限制性酶切法检测基因打靶情况,随后进行测序分析确定编辑效果.通过O-dianisidine染色分析血红蛋白合成情况,中性粒细胞染色分析中性粒细胞生成情况,利用Real-time PCR检测p53、mdm2、hsp70和造血相关转录因子基因的表达变化.结果 成功制备了rpl15 gRNA,并筛选得到rpl15突变体.rpl15基因敲除的幼鱼出现体长缩短、尾部弯曲、头部和眼睛较小及心包水肿的表型;造血相关谱系染色结果显示rpl15突变体血红蛋白合成明显减少,但中性粒细胞生成未受影响;rpl15突变体p53和mdm2的mRNA表达均显著升高(P＜0.01,P＜0.05,),α-globin、gatal和hsp70的mRNA表达均显著下调(P＜0.01,P＜0.05,P＜0.05),除红系外的造血相关转录因子的mRNA表达与对照组相比均无明显差异.结论 利用CRISPR/Cas9技术成功编辑了斑马鱼rpl15基因,突变体产生了类似先天性纯红细胞再生障碍性贫血疾病的表型.同时表明p53与hsp70可能参与调控突变体表型的形成.