杜氏利什曼原虫amastin基因重组真核表达质粒的构建与表达

目的：构建杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白（alllastin）编码基因的真核表达重组质粒pcDNA3．1-amastin，并研究其在NIH3T3细胞中的表达。方法：提取杜氏利什曼原虫基因组DNA进行PCR扩增。将扩增的无鞭毛体蛋白基因片段导入质粒pcDNA3．1（＋）中，构建真核表达重组质粒pcDNA3．1-amastin。以pcDNA3．1-amastin转染NIH3T3细胞，采用免疫荧光染色法和RT-PCR分别鉴定pcDNA3．1-amastin的瞬时表达和稳定表达。结果：在细胞膜和细胞内均观察到较强的绿色荧光，表明pcDNA3．1-amastin成功地转入NIH3T3细胞，并在细胞膜和细胞内获得短暂表达。稳定转染的NIH3T3细胞的总RNA经反转录后，用PCR扩增出无鞭毛体蛋白基因，表明获得了稳定表达。结论：成功地构建杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因的真核表达重组质粒，并且该基因在NIH3T3细胞中获得了稳定表达。     

利什曼原虫无鞭毛体超微结构及其在病犬体内分布的研究

作者用透射电镜研究了四川南坪疫区利什曼病犬肝、脾内无鞭毛体的超微结构。观察到其膜下微管数为81—135,平均101±10。微管平均直径和微管间距分别为31±8.6nm和28±0.65nm。对比文献资料,与从貉和美国Oklahoma犬等动物体内获得的无鞭毛体膜下微管数有明显不同;而与观察人体利什曼原虫所获结果相近。为进一步研究人体利什曼病与病犬的关系提供了线索。研究还发现病犬前肢、耳、鼻皮肤内无鞭毛体数量较多;内脏中以颈淋巴结内数量最多,其次为肝、脾,以下依次为骨髓、胰、睾丸、附睾。肺内仅遇见原虫。由于前肢皮肤原虫数量(3616.3±174.6)可高出骨髓(397±37.7)近10倍,为自多处皮肤取材用于诊断提供了客观依据。另外,首次从病犬延髓印片中查见无鞭毛体,提示其侵犯中枢神经系统的危害性是存在的。     

抗杜氏利什曼原虫保护性单克隆抗体的研究

目前,黑热病的发病率有回升的趋势,受到国内外广泛重视。甘肃、四川两省自1983年发病人数逐年上升。其主要传染源均为病犬。犬的感染率高达8.5～2.5％。鉴于本实验室通过K-DNA分子杂交技术,发现杜氏利什曼原虫四川人分离株与犬分离株K-DNA微环碱基序列不完全同源,以及它们之间蛋白质组成分析的差异的存在,本科研为此制备出抗犬分离株前鞭毛体膜抗原单克隆抗体,并通过下述实验研究其保护性功能。     

杜氏利什曼原虫遗传转化中潮霉素及嘌呤霉素适宜浓度的筛选

通过基因打靶构建基因缺失株是利什曼原虫分子水平研究的有效方法,而筛选特定的转化体是研究成功的第1步。筛选转化体常用抗生素筛选法。本文通过观察潮霉素和嘌呤霉素不同质量浓度对杜氏利什曼原虫四川分离株的生长抑制情况,确定了在抗性基因转化的阳性克隆筛选中,潮霉素及嘌呤霉素的适宜筛选浓度分别为32和10μg／mL。本实验的结果为下一步筛选杜氏利什曼原虫基因缺失株提供了可靠的实验依据。     

抗杜氏利什曼原虫单克隆抗体的研究——对新疆株保护性抗体的探索(摘要)

本文报道用杜氏利什曼新疆株前鞭毛体免疫BALB/C小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞系SP2/O融合,融合率为91.7％。经用ELlSA法检测抗体,获得9个分泌抗体的杂交瘤细胞孔(阳性率为26.5％)。选择其中一个稳定的分泌抗体的B细胞株进行再克隆后,用7个呈单个克隆细胞生长阳性孔获得的腹水作了进一步研究。7个McAbs的特异抗体滴度在1:12,800～1:839,200之间(ELISA),又经间接荧光法证实且进一步筛选发现,其中E_(12)、A_(11) McAbs具有一定保护性功能。     

杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因重组质粒的免疫原性研究

目的研究杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因重组质粒pcDNA3.1-amastin的免疫原性。方法将18只雌性BALB/c小鼠随机分为实验组和对照组,每组9只。两组分别肌肉注射重组质粒pcDNA3.1-amastin和空质粒pcDNA3.1(+)(50μg/只),2周后同法加强免疫1次。加强免疫后第7、14和21天每组各取小鼠3只,内眦采血,分离血清,间接ELISA法测定血清中抗原特异性抗体水平。随后脱颈处死小鼠,无菌取脾,分离脾细胞,用刀豆球蛋白A刺激培养,3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)法检测脾淋巴细胞增殖活性和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤活性。双抗体夹心ELISA法检测脾淋巴细胞培养上清中γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素-2(IL-2)和IL-4的水平。结果加强免疫后第7、14和21天,实验组均检测到特异性IgG抗体,效价在1∶640以上,而对照组未检测到IgG抗体(P<0.01);实验组脾淋巴细胞增殖活性刺激指数分别为4.28±0.51、5.01±0.60和4.39±0.50,均高于对照组(P<0.01);实验组脾淋巴细胞培养上清中IFN-γ含量分别为(42.06±...     

疟疾细胞介导免疫研究近况

目前,疟疾仍然是危害人民健康十分严重的一种寄生虫病,特别是热带和亚热带地区的一些国家,疟疾仍然猖獗流行。全世界都在重视着疟疾防治的研究。研究和制备疟疾疫苗(虫苗),为防治和消灭疟疾提供一条新的途经,是疟疾免疫研究的重要意义之一,而疟疾抗体测定及细胞介导免疫的研究又是虫苗研制工作中不可缺少的环节。人体对疟疾的免疫情况 (一)先天抵抗力有些地区的人种或人群对感染某种疟原虫具有一定的先天抵抗力,这种抵抗力与疟疾感染史无关,而与种族遗传有关。如在西部非洲,黑人对间日     

杜氏利什曼原虫LACK抗原基因的克隆和表达

目的　在大肠杆菌中高效表达纯化杜氏利什曼原虫的LACK抗原。方法　以本实验室的重组质粒T -LACK为模板 ,PCR扩增得到LACK抗原基因 ,与表达载体pQE31定向重组 ,转化到宿主菌M 15中进行表达和纯化 ,并以SDS -PAGE和Western -blotting进行鉴定。结果　 1 SDS -PAGE电泳检测 ,重组质粒 pQE31-LACK的全菌蛋白没有出现明显的特异表达带 ,而纯化蛋白和包涵体溶解物在 36kDa处均出现了特异的表达带。 2 36kDa的纯化蛋白被抗利什曼原虫鼠血清清晰地识别。结论　得到了高效表达的LACK纯化蛋白 ,并有免疫原性     

用PCR扩增及Southern印迹杂交对新疆克拉玛依地区皮肤利什曼病病原体kDNA同源性研究

本研究自新疆克拉玛依地区皮肤利什曼病（ＣＬ）患者的皮肤病变组织内抽取微量的利什曼原虫ｋＤＮＡ，采用引物１３Ａ、１３Ｂ进行ＰＣＲ扩增，获１２０ｈＰ扩增产物（ＣＬ－ＰＣＲ－ＡＰ），并转移到尼龙膜上，分别与地高辛（Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ－１１－ｄＵＴＰ）标记的Ｌ．ｔｒｏｐｉｃａ、Ｌ．ｉｎｆａｎｔｕｍ、Ｌ．ｇｅｒｂｉｌｌｉ、Ｌ．ｍａｊｏｒｋＤＮＡ探针进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交，结果可见病变组织内ｋＤＮＡＰＣＲ－ＡＰ仅与Ｌ．ｔｒｏｐｉｃａｋＤＮＡ探针有明显的杂交信号带，提示该地区皮肤利什曼病病原体ｋＤＮＡ与Ｌ．ｔｒｏｐｉｃａ有较强的同源性。为进一步分析该病原体与Ｌ．ｉｎｆａｎｔｕｍ和Ｌ．ｄｏｎｏｖａｎｉ新疆各分离株的同源关系，我们采用杜氏利什曼原虫（Ｌ．ｄ）种特异引物Ⅰ和Ⅱ对患者病变组织进行ＰＣＲ扩增，未见扩增产物。用地高辛标记的ＣＬ－ＰＣＲ－ＡＰ探针对Ｌ．ｄｏｎｏｖａｎｉ新疆各分离株进行打点杂交，结果显示该地区ＣＬ病原体与Ｌ．ｄｏｎｏｖａｎｉ新疆分离株以及其它利什曼原虫呈阴性反应。以上结果证实Ｌ．ｔｒｏｐｉｃａｋＤＮＡ与克拉玛依地区ＣＬ患者的ＣＬ－ＰＣＲ－ＡＰ之间的同源关系。