马尔尼菲青霉菌溶血磷脂酶基因的克隆、表达及纯化

目的 研究马尔尼菲青霉菌(PM)溶血磷脂酶(LysoPLs)基因的克隆、表达和纯化,为研究其致病机制奠定基础.方法 采用生物信息学方法,从PM酵母相全长 cDNA 文库中识别出PMLysoPLs基因的同源序列及其全长编码区.通过PCR方法 扩增PMLysoPLs基因的编码区序列,构建原核表达载体pET 30a(+)-PMLysoPLs,经DNA 序列测定鉴定其序列,在大肠埃希菌BL-21/DE3中用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,重组产物采用His-镍蛋白纯化柱进行纯化.结果 PMLysoPLs基因长度为991 bp,其全长编码序列长度为732 bp,编码243个氨基酸,其编码蛋白理论分子量为26.8 kDa.重组表达载体经序列测定及酶切鉴定与理论推测结果 相符.经IPTG诱导,该基因在大肠埃希菌BL-21/DE3中得到高效的可溶性上清表达,纯化后的重组蛋白分子量为25~35 kDa,其单一蛋白纯度达95%以上.结论 本研究成功构建了PMLysoPLs基因的pET 30a(+)原核重组质粒,获得的可溶性重组蛋白表达效率高,可用于进一步研究PM溶血磷脂酶的功能.     

HIV/HCV合并感染者外周血中IP-10水平及其与肝损害的相关性

目的研究炎性因子IP-10在人类免疫缺陷病毒/丙型肝炎病毒(HIV/HCV)合并者外周血中的表达水平及其对肝功能、HIV和HCV复制水平的影响。方法以未经抗病毒治疗的慢性丙型肝炎患者(HCV单一感染)、AIDS患者(HIV单一感染者,CD4~+T200个/mm~3)和HIV/HCV合并感染者(CD4~+T200个/mm3)为研究对象,并以健康志愿者作对照,抽取外周静脉血,分离血浆,ELISA检测血浆中IP-10的表达量,real-time PCR定量检测血浆中HIV病毒载量、HCV病毒载量,同时检测丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平。结果相对于健康对照组,HIV单一感染组和HCV单一感染组的血浆IP-10水平显著升高(均为P0.01);HIV/HCV合并感染组IP-10表达水平高于HCV单一感染组(P0.01),HIV单一感染组稍高于HCV单一感染组(P0.01);IP-10与ALT、HIV病毒载量及HCV病毒载量间无明显的相关性(均为P0.05)。结论 HIV/HCV合并感染者外周血中高表达炎性因子IP-10,但IP-10对病毒复制及肝脏炎症并无明显影响。     

两种实时荧光定量聚合酶链反应检测血清HCV RNA的比较

目的 比较全自动病毒载量检测系统(COBAS TaqMan)和国产荧光定量PCR试剂盒对血清HCV RNA载量的检测结果,探讨两种检测方法在临床诊断和治疗中的应用价值.方法 收集26例慢性丙型肝炎患者抗病毒治疗前和治疗过程中2、4、8、12、24、36和48周的系列血标本,共168份,采用COBAS TaqMan 48全自动分析系统和广州某国产TaqMan实时PCR试剂盒分别检测系列血清中的HCV RNA载量.统计学处理采用x2检验和t检验.结果 当血清HCV RNA≥1×104IU/mL时(0周),COBAS检测和国产试剂盒均能很好测定HCV载量,而且国产试剂盒检测值为1.35×107IU/mL高于COBAS检测值2.21×106IU/mL,差异有统计学意义(t=2.05,P<0.05);血清HCV RNA<1×104IU/mL时(2～48周),COBAS检测出的HCV阳性率为21.4%(30/140),远高于国产试剂盒的1.4%(2/140),差异有统计学意义(t=3.66,P<0.01);治疗4周时,COBAS检测26例患者中14例血清HCV为阳性,12例病毒载量低于检测下限,获得快速病毒学应答(RVR);国产试剂盒检测结果为3例血清HCV为阳性,23例获得RVR.COBAS与国产试剂盒梧比,转阴率差异有统计学意义(x2=10.575,P<0.01).治疗12周时,COBAS检测完全早期病毒学应答(cEVR)率为95.7%(22/23),国产试剂盒检测的cEVR为100%(17/17),差异无统计学意义(x2=0.726,P>0.05).结论 国产荧光定量PCR试剂盒可用于HCV疑似患者的筛查和高HCVRNA载量者的确诊,对于低HCV RNA载量的疑似患者和抗病毒治疗过程中HCV载量的检测,COBAS则更为敏感.

Abstract：

Objective To compare the plasma hepatitis C virus(HCV)RNA levels detected by the fully automated viral load detection system(COBAS TaqMan)and the national real-time quantitative polymerase chain reaction(PCR)kit,and to investigate the clinical application value of these two methods in clinical practice.Methods A total of 168 serial plasma samples collected from 26 patients with chronic hepatitis C(CHC)before and at week 2,4,12,24,36 and 48 of antiviral treatment were detected by both COBAS Taqman 48 analyzing system and the national real-time quantitative PCR kit.The results of two methods were compared by chi square test and t test.Resnlts Both COBAS and national kit showed great positive detecting results when HCV RNA≥1×104IU/mL(at week O),and the virus load value detected by national kit was significantly higher than that detected by COBAS(t=2.05,P<0.05).However,when HCV RNA<1×104(at week 2-48),the positive rate of HCV detected by COBAS was significantly higher than that detected by national kit (t=3.66,P<0.01).At week 4 of treatment,the rapid virological response(RVR)rate was 46.2 % (12/26)detected by COBAS,while that was 88.5%(23/26)detected by national kit,and the difference was significant(x2=10.575,P<0.01).At week 12 of treatment,the complete early virological response(cEVR)was 95.7%(22/23)detected by COBAS,while that was 100%(17/17)detected by national kit,and the difference was not significant(x2=0.726,P>0.05).Conclusions The national TaqMan real-time quantitative PCR kits could be used to screen the suspected cases of HCV infecrion and to diagnose CHC cases with high HCV virus load.COBAS detection is more sensitive in cases with low HCV virus load and in on-treatment monitor during anti-HCV therapy.     

HBV小鼠动物模型的研发进展

HBV是导致肝硬化和肝细胞癌的主要原因。目前全球约有2.4亿HBV感染者,其中每年约100万人死于HBV所引起的肝脏疾病,是全球主要的公共卫生问题之一。然而HBV是宿主种属特异性极强的嗜肝病毒,只能在几种特定的动物中感染复制。因此,研究支持HBV感染的动物模型,对HBV感染和致病机制的认识,以及有效治疗方案的快速研发具有重要的作用。当前,HBV感染模型的不断升级有力推动了HBV的病毒学研究,特别是HBV小鼠模型的不断开发为HBV研究提供了便捷的研究工具,本文将对这一领域的研究作一综述。     

HIV/AIDS患者外周血白细胞TLR-1、-2、-4和-6表达的初步研究

目的了解HIV/AIDS患者外周血白细胞Toll样受体(TLRs)的表达及其在HIV/AIDS疾病过程中的意义。方法应用流式细胞仪检测20例HIV/AIDS患者和15例健康人外周血多型核粒细胞、淋巴细胞和单核细胞表面TLR-1、TLR-2、TLR-4和TLR-6的表达水平。结果 TLR-1、TLR-2、TLR-4和TLR-6在外周血白细胞表面均有表达,与健康对照组比较,HIV/AIDS患者多型核粒细胞TLR-1[(967.44±215.01)%vs(1 159.51±210.17)%,P=0.014]、TLR-2[(1 614.91±346.66)%vs(2 101.87±236.28)%,P<0.001]、TLR-4[(1 735.31±443.28)%vs(2 539.08±842.96)%,P<0.001]和TLR-6[(1 102.96±259.32)%vs(1 357.36±155.49)%,P<0.001]的表达水平显著降低;淋巴细胞TLR-1[(922.09±271.04)%vs(728.19±184.31)%,P=0.024]、TLR-2[(961.81±419.21)%vs(617.72±2...     

乙型肝炎病毒增强子Ⅰ/X基因启动子变异与HBV慢性感染疾病谱的关系

目的 探讨乙型肝炎病毒增强子Ⅰ (HBV Enh Ⅰ)/X基因启动子变异与乙型肝炎病毒慢性化感染疾病谱的关系.方法 随机收集275例HBV感染者的血清标本,包括慢性乙型肝炎( CHB) 100例,肝硬化(LC)74例,肝细胞癌(HCC) 101例.以入选病例的基因型为分组,采用半巢式PCR的方法扩增HBV Enh Ⅰ/X基因启动子并测序,测序结果与HBV参照序列比对,确定变异位点,使用x2检验和多变量logistic回归进行数据分析.结果 ①HBV基因分型结果:HBV B基因型患者158例(61.48％),包括CHB 70例,LC 36例,HCC 52例;HBV C基因型患者117例(38.52％),包括CHB 30例,LC 38例,HCC 49例.②HBV B基因型A1123Y变异在LC组明显高于CHB组(30.56％vs.8.58％,x2=8.533,P=0.005,A=4.693,95％ CI[1.567～14.056]),HCC组明显高于CHB组(28.85％ vs.8.58％,x2 =8.607,P=0.003,OR=4.324,95％ CI[1.544 ～ 12.109]);A1317G变异在HCC组明显高于CHB组(30.77％ vs.7.14％,x2=11.687,P=0.001,A=5.778,95％ CI[1.955～17.076]).HBV C基因型T1323C变异在HCC组明显高于CHB组(30.61％ vs.6.67％,x2 =6.318,P=0.012,A=6.176,95％ CI[1.301～29.331]).③多变量logistic回归分析发现A1317G(A =5.706,95％ CI[1.770 ～ 18.837],P =0.004)和T1323C (A =5.810,95％ CI[1.114 ～30.306],P =0.037)变异是HCC发生的独立危险因素.结论 乙型肝炎病毒增强子Ⅰ/x基因启动子突变与肝硬化、肝癌的发生有关,对变异位点的检测有助于预测肝硬化和肝癌的发生.     

艾滋病患者马尔尼菲青霉菌优势株酵母相全长cDNA文库的构建和初步分析

目的 构建广东地区艾滋病患者马尔尼菲青霉菌(PM)优势株酵母相全长cDNA文库,筛选UniGene和全长基因,为PM的功能基因组学研究和致病机制的探讨奠定基础.方法 应用CloneMiner cDNA construction kit提取广东地区艾滋病患者PM优势株酵母相mRNA,反转录成cDNA后通过BP重组方法克隆进pDONR222载体制备成Uncut型cDNA文库,然后利用基因组DNA饱和杂交原理,对Uncut型cDNA文库进行均一化处理,构建均一化cDNA文库.针对均一化文库,随机挑取2000个克隆子进行双向测序,并进行生物信息学分析,筛选UniGene和全长基因.结果 Uncut型cDNA文库总克隆数为1.16×107 cfu/mL,重组率95%,平均插入片段长度＞1 kb;均一化文库总克隆数为1.18×106 cfu/mL,重组率95%,平均插入片段长度＞1 kb.测序获得1945条基因片段长度＞1 kb的序列,归并获得1360个UniGene,632个全长基因.结论 所构建的艾滋病患者PM优势株全长cDNA文库质量较好,采用的技术路线获取全长基因建立基因表达谱的效率较高,可以很好满足下一步实验需要.     

华支睾吸虫溶血磷脂酶在虫体组织定位及其特异性抗体类型分析

目的观察华支睾吸虫溶血磷脂酶(CsLysoPLA)在成虫的组织定位,分析其诱导人体产生的特异性抗体类型。方法应用免疫荧光方法,观察CsLysoPLA在成虫的组织定位;应用ELISA方法,CsLysoPLA重组蛋白检测25份华支睾吸虫病人血清的IgG1、IgG2、IgG4、IgE。结果CsLysoPLA定位于虫体的口吸盘、排泄囊、肠支、生殖孔,与虫体分泌/排泄抗原物质密切相关的部位;以CsLysoPLA重组蛋白检测华支睾吸虫感染者血清,IgG1抗体水平较高,IgG2抗体水平稍高,而感染者的IgG4、IgE水平则与健康人无明显差异。结论CsLysoPLA主要经虫体消化道、生殖道、排泄系统分泌/排泄到体外,刺激人体免疫系统产生Th2为主的免疫应答。     

艾滋病合并慢性乙型肝炎感染患者对拉米夫定耐药的研究CSCD

目的了解拉米夫定（3TC）治疗艾滋病（AIDS）/慢性乙型肝炎（CHB）合并感染患者对3TC的耐药情况。方法收集广州市第八人民医院2005年至2010年接受含3TC方案治疗的AIDS/CHB合并感染患者的资料,检测患者抗病毒治疗前和治疗12个月、24个月、36个月、48个月和60个月时HBV DNA含量,对HBV DNA阳性患者,扩增HBV逆转录酶区,分析HBV变异情况。结果185例患者符合入选标准,治疗前均未发现3TC耐药。治疗过程中,有29例患者检出3TC耐药,其中7例患者在两个不同的随访点检出耐药。29例患者中,有9例治疗前HBV DNA阴性,3例患者是治疗12个月时检出耐药。与非耐药患者相比,耐药患者HBeAg阳性的比例更高（65.5%比33.3%,P＝0.001）,基线HBV DNA水平更高（7.49拷贝/ml比6.59拷贝/ml,P＝0.017）,使用3TC时间明显延长（40个月比26.5个月,P〈0.001）。3TC耐药模式有四种：rtM204I （n＝7）、rtL180M （n＝2）、rtL180M＋rtM204V/I（n＝23）和rtL80V＋rtM204I （n＝4）。结论本地区AIDS/CHB合并感染患者对3TC耐药率低。治疗前HBV DNA阴性患者亦可较早出现耐药。     

干扰素对HIV／HCV合并感染者抗HCV早期疗效观察

目的通过分析HIV/HCV合并感染者使用长效/普通干扰素联合利巴韦林抗HCV早期治疗效果,探讨更适合我国国情的HIV/HCV合并感染的抗HCV治疗方案。方法 129例经HAART治疗的HIV/HCV合并感染者随机选用PEG-IFN-α-2a或IFN-α-2b联合利巴韦林治疗,利用巢氏PCR加测序分析检测HCV基因分型,COBASTM全自动病毒载量分析系统分别检测抗HCV治疗前、治疗后4周、12周的外周血HCVRNA载量,获得HIV/HCV合并感染者抗HCV快速病毒学应答率（RVR）、早期病毒学应答率（EVR）。结果我国HIV/HCV合并感染者中,HCV基因型为1型患者占34.0%,非1型者占66.0%。使用普通干扰素抗HCV治疗组RVR、EVR、cEVR与PEG干扰素组比较无显著差异;普通干扰素组中HCV非基因1型早期治疗效果优于HCV基因1型（P〈0.05）,PEG干扰素组HCV-1型和非1型早期治疗效果比较无显著差异;PEG及普通干扰素在抗HCV治疗过程中对患者肝功能的恢复均有积极效用（P〈0.05）。结论 PEG及普通干扰素联合利巴韦林抗HCV方案治疗我国HIV/HCV合并感染者均能取得较好的早期疗效。普通干扰素方案对HCV非基因1型HIV/HCV合并感染者中可获得良好的早期治疗效果。