视网膜疾病的蛋白质组研究

蛋白质组学是研究细胞内所有蛋白质的组成及其动态变化规律的科学,它是在蛋白质水平定量、动态、整体地研究生物体,并在更深层次上获得对疾病的发病机制、过程以及药物治疗靶点的新的认识，但在眼部尤其是视网膜中的研究尚处于起步阶段。现对蛋白质组学的概念、研究内容、相关技术和在视网膜中的研究现状进行综述。(中华眼底病杂志,2005,21:199-202)     

维甲酸对胚胎干细胞分化过程中Notch1表达的影响

目的探讨维甲酸(RA)诱导胚胎干细胞(ESC)向神经细胞定向分化及自由分化过程中,Notch1蛋白和mRNA的时空表达以及RA对Notch1表达的影响。方法实验分两组:实验组用RA对ESC进行神经细胞定向诱导分化,对照组ESC进行自由分化。各组分别取ESC分化1、3、5、7、9d的细胞,倒置显微镜观察形态变化,免疫荧光观察MAP2表达,免疫细胞化学、流式细胞术及RTPCR检测Notch1蛋白和mRNA表达。结果实验组诱导分化的神经元逐渐增多并形成神经网络。对照组以圆形上皮样分化细胞为主。ESCNotch1蛋白及mRNA均为高表达,诱导分化或自由分化后蛋白表达降低(P<0.05)。实验组Notch1mRNA水平下降(P<0.05),对照组则无明显变化(P>0.05)。分化3d后,实验组各时间点Notch1的表达水平均低于对照组(P<0.05)。结论ESC分化时伴有Notch1信号的关闭。Notch1可能对ESC向神经元的特异性分化起重要作用。促进Notch1的下调可能是RA诱导分化的机制之一。     

GM-1对大鼠视网膜缺血再灌注损伤后NF-кB表达的影响

目的:观察神经节苷脂(monosialoganglioside,GM-1)对大鼠视网膜缺血再灌注损伤后视网膜结构的保护作用及对核因子-кB(nuclear factor-kappaB,NF-кB)表达的影响,探讨其可能的保护机制.方法:健康成年Wistar大鼠75只,随机分为3组:正常组5只、NS组35只、GM-1组35只.正常组不加任何处理因素,NS组和GM-1组通过升高眼压造成视网膜缺血60min,分别于缺血前12、1 h及缺血结束时3次腹腔注射NS3 ml·kg-1或GM-1 3 ml·kg-1,并于再灌注0(单纯缺血后)、1、6、12、72、72和168 h共7个时点取双眼眼球,每时间点5只.HE染色观察视网膜组织结构并测量视网膜内层平均厚度(mean thickness of the inner retinal layers,MTIRL),免疫组化SP法检测NF-кB的表达并计算阳性细胞率.方差分析法进行统计处理.结果:大鼠视网膜缺血再灌注后,内层视网膜相继出现水肿和萎缩.再灌注后大鼠视网膜内层NF-кB迅速激活,随后其表达逐渐下降.GM-1可明显减轻视网膜缺血再灌注后的组织损伤,并显著抑制NF-кB的活化.结论:NF-кB活化可能是视网膜缺血再灌注损伤的早期始动因素.GM-1对视网膜缺血再灌注损伤具有明确的保护作用,对NF-кB的抑制可能是其保护机制之一.     

胚胎干细胞直接向神经细胞诱导分化的实验研究

目的:探讨不经拟胚体(EB)培养阶段，应用维甲酸(RA)在体外直接将胚胎干细胞(ESC)诱导分化为神经细胞的可行性和效果。 方法:ESC消化后分为A、B、C、D 4组，A、B组进行EB培养后，A组用RA进行诱导分化，B组不添加RA使其自由分化,C、D组不经EB培养阶段，C组直接用RA诱导分化，D组自由分化。倒置相差显微镜及扫描电镜观察细胞形态变化，免疫细胞化学及流式细胞术观察各组第 9 d 分化细胞微管相关蛋白-2(MAP-2)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达情况。 结果:A、C组诱导分化的神经样细胞逐渐增多，并形成密集的神经网络样结构，9 d 时大部分为MAP-2阳性细胞，MAP-2阳性率显著高于B、D组(P<0.01)。B、D组以圆形上皮样分化细胞为主，9 d 时绝大部分为GFAP阳性细胞，GFAP阳性率显著高于A、C组(P<0.01)。A、C组之间或B、D组之间的MAP-2及GFAP阳性率均无显著差异(P>0.05)。 结论:在体外，可不经EB阶段，应用RA直接将ESC诱导分化为神经细胞，改良的ESC诱导分化方法与传统的RA4-/4+方法效果相同，可取代传统方法。     

视网膜疾病的蛋白质组研究

蛋白质组学是研究细胞内所有蛋白质的组成及其动态变化规律的科学,它是在蛋白质水平定量、动态、整体地研究生物体,并在更深层次上获得对疾病的发病机制、过程以及药物治疗靶点的新的认识,但在眼部尤其是视网膜中的研究尚处于起步阶段.现对蛋白质组学的概念、研究内容、相关技术和在视网膜中的研究现状进行综述.     

Ⅰ型前弹力层角膜营养不良患者角膜与正常角膜蛋白的差异表达

目的 探讨中国人Ⅰ型前弹力层角膜营养不良(corneal dystrophy of Bowman laver type 1,CDB1)患者角膜与正常角膜的蛋白差异表达.方法 取1个CDB1家系3例患者外周血,提取基因组DNA,PCR扩增TGFBI基因第4、11、12、14外显子片段并进行直接测序,证实其突变位点.取板层或穿透性角膜移植术后的病变角膜,部分标本行HE染色、阿辛蓝、PAS、刚果红、Masson三色染色后光学显微镜观察,剩余标本提取组织蛋白后进行双向凝胶电泳.以3例正常角膜组织为对照.结果 3例CDBI患者均发现TGFBI基因R124L突变.HE染色证实病变主要累及前弹力层,PAS、刚果红、Masson三色染色阳性,阿辛蓝染色阴性.在PI 4-7,相对分子质量7×103～30×103之间病变与正常角膜蛋白表达存在27个差异点.结论 中国人CDB1患者以R124L基因突变为主.CDB1角膜异常沉着性质为细胞外淀粉样纤维蛋白沉着.在PI 4-7,相对分子质量7×103～30×103之间的差异蛋白可能在CDB1发病过程中起着重要作用.     

共焦显微镜在角膜营养不良诊断中的应用

目的 探讨共焦显微镜在角膜营养不良诊断中的应用价值。设计 病例系列研究。研究对象 6例角膜营养不良，包括4例Reis-Bueckleas角膜营养不良、1例角膜斑点状营养不良、1例。Fuchs角膜内皮营养不良。方法 患者双眼行裂隙灯显微镜及共焦显微镜检查，选择病变在不同角膜层次的共焦显微镜图像，对角膜沉淀进行形态学评价，并与裂隙灯检查比较。主要指标角膜病变的裂隙灯显微镜及共焦显微镜图像。结果 共焦显微镜显示Reis-Bficklers角膜营养不良病变主要累及前部基质，包括角膜上皮、基底细胞及前弹力层；斑点状角膜营养不良病变仅累及基质层，而角膜上皮层及内皮层正常；在Fuchs角膜内皮营养不良中，可直接观察角膜小滴及角膜内皮情况。结论 共焦显微镜检查提供了一种评价角膜病变的方法，较裂隙灯显微镜的分辨率高。     

I型角膜前弹力层营养不良的组织病理学与超微结构研究

目的:探讨Ⅰ型角膜前弹力层营养不良(cornealdystrophyofBowmanlayer,CDBI)的组织病理学和超微结构改变。方法:取2家系中4例CDBI患者板层或穿透性角膜移植术后的病变角膜,部分标本HE及特殊染色后行光学显微镜观察,部分标本做超薄切片,透射电子显微镜观察超微结构。以2例正常角膜组织标本为对照。结果:CDBI患者角膜上皮细胞微绒毛减少或消失,基底细胞间有小块高电子密度物质,基底细胞出现凋亡现象,前弹力层及前部基质中可见大量棒状高电子密度沉淀物。结论:CDBI患者角膜有特征性的结构改变,可能是造成其临床症状的原因之一。     

Notch1蛋白在胚胎干细胞向神经细胞诱导分化过程中的表达及意义

目的探讨胚胎干细胞（ESC）向神经细胞（NC）定向诱导分化过程中跨膜信号分子Notch1蛋白的表达情况及意义。方法体外培养ESC,在培养基内添加5×10^-7mol/L维甲酸（RA）进行诱导分化。分别取ESC及RA诱导分化1、5、9d的细胞,倒置相差显微镜观察细胞形态变化,免疫细胞化学、Western Blot法及流式细胞术检测各相应时间点Notch1蛋白的表达。结果随诱导时间延长,ESC分化出的成熟神经元标志微管相关蛋白（MAP-2）阳性神经细胞逐渐增多,并形成较为单一密集的神经网络结构。ESC阶段Notch1蛋白为高水平表达,诱导分化后Notch1蛋白表达随时间延长逐渐下降。结论在ESC向NC的诱导分化过程中,Notch1信号逐渐关闭;Notch1可能对ESC向NC的特异性分化起重要作用。     

肺淋巴管肌瘤病动物模型的构建及临床应用的研究进展

肺淋巴管肌瘤病(PLAM)是一种好发于育龄期女性的低度恶性肿瘤性疾病, 有效动物模型的缺乏一直是其机制研究的瓶颈。现有PLAM动物模型包括注射结节性硬化症复合体基因2(TSC2)缺失肿瘤细胞的移植瘤小鼠模型和TSC基因敲除的转基因小鼠模型, 其中移植瘤小鼠模型包括同种异体移植瘤、人源化异种移植瘤和大鼠源性异种移植瘤, 转基因小鼠模型包括胚系基因敲除和条件性基因敲除小鼠。部分PLAM动物模型存在PLAM样肺部病变, 主要用于寻找PLAM新的治疗靶点和PLAM肿瘤细胞来源, 但并不能完全代表PLAM患者的疾病发展。本文总结了目前所有PLAM动物模型的特点及临床应用情况, 并结合笔者研究经验着重分析近6年的研究进展, 以期供该领域学者参考。