RNAi及其实验技术进展

RNA干扰 (RNAi)是由双链RNA(dsRNA)引发的转录后基因沉默 (PTGS)机制 ,具有普遍的生物学意义。dsRNA经DICER酶切割为 2 1～ 2 3核苷酸长的小分子干扰RNA片段 (siRNA) ,可以高效、特异地阻断体内特定基因表达 ,促使mRNA降解 ,诱使细胞表现出特定基因缺失的表型。由于能够迅速而简单地制备某个基因功能缺失表型 ,RNAi实验技术的发展将为基因或蛋白功能研究、药物筛选、信号通路分析、基因治疗等提供新的重要研究手段和技术平台。     

NF-κB/I-κB在过氧化氢所致心肌细胞损伤中的作用机制

【目的】探讨氧化应激损伤心肌细胞的分子机制。【方法】采用 0 .5mmol/L过氧化氢 (hydrogenperoxide ,H2 O2 )作用于原代培养的新生大鼠心肌细胞 ;采用胎盘蓝染色检测细胞死亡率 ,乳酸脱氢酶 (LDH)测定试剂盒检测其释放率 ,末端标记检测细胞凋亡 ,Westernblot检测NF κB内源性抑制蛋白I κB (inhibitorκB ,I κB)含量 ,免疫组化检测NF κB在细胞内的分布情况。【结果】①H2 O2 损伤 3h ,心肌细胞死亡率和LDH释放率均较对照组明显升高 (P <0 .0 1) ;②H2 O2 损伤 2 4h ,出现大量心肌细胞凋亡 ;③I κB在H2 O2 损伤 5min即减少 ,15min时减至最低 ,而后逐渐恢复 ;④H2 O2 损伤 0 .5h可引起心肌细胞中NF κB从胞浆向胞核移位 ,2h后复位 ;⑤与单纯损伤组比 ,NF κB抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸盐 (pyrrolidinedithiocarbamate,PDTC)能明显降低心肌细胞LDH释放率 (P <0 .0 1)。【结论】在H2 O2 所致心肌细胞损伤中 ,既有坏死 ,又有凋亡的发生 ,而NF κB/I κB信号通路的激活可能介导了H2 O2 所致的心肌细胞损伤。     

Kruppel样因子4过表达对C2C12肌原细胞中热休克蛋白25表达的影响

目的观察Kruppel样因子4过表达对热休克蛋白25表达的影响。方法运用稳定转染pcDNA3.1/myc-His(-)和Kruppel样因子4-pcDNA3.1/myc-His(-)两种细胞株,采用逆转录聚合酶链反应观察Kruppel样因子4在生理状态和热休克反应时对热休克蛋白25 mRNA表达的影响;采用Western blot观察Kruppel样因子4在生理状态和热休克反应时对热休克蛋白25蛋白表达的影响。结果在正常状态下,两种细胞热休克蛋白25 mRNA及蛋白表达水平均较低。生理状态下,热休克恢复1 h及3 h Kruppel样因子4过表达细胞株热休克蛋白25 mRNA表达水平明显高于转空载体细胞;至热休克恢复6 h后两组细胞热休克蛋白25 mRNA表达无明显差异。在生理状态及热休克恢复不同时间后,Kruppel样因子4过表达细胞热休克蛋白25蛋白表达水平均较空载体组明显增加。结论在生理状态下和热休克反应中,Kruppel样因子4过表达均能够促进C2C12肌原细胞中热休克蛋白25高表达。     

过氧化氢对K562细胞凋亡的影响

目的：探讨活性氧对K562细胞凋亡的影响。方法：用过氧化氢(hydrogen peroxide，H2O2)作用于对数生长期的K562细胞。结果：Hoechst 33258染色法观察到K562细胞明显凋亡；caspase活性定量测定及Western Blotting检测显示caspase-3，-8，-9同时被激活。结论：H2O2可诱导K562细胞凋亡，且通过同时激活线粒体途径和死亡受体途径起作用。     

采用cDNA芯片结合聚类分析研究大鼠心肌缺血预适应的基因表达谱改变

中南大学湘雅医院袁灿、肖献忠等为深入研究心肌缺血预适应的分子机制 ,采用含 4 2 0 0个基因的ｃＤ ＮＡ芯片检测了大鼠心肌缺血预适应不同时间点的基因表达改变情况 ,并采用ＳＯＭ对具有相同表达模式的基因进行聚类分析 ,获得了多个新的与心肌缺血预适应相关的已知基因和可能代表新基因的ＥＳＴ片段。进一步分析这些已知和未知基因可能为揭示心肌缺血预适应的分子机制提供新的线索和思路采用cDNA芯片结合聚类分析研究大鼠心肌缺血预适应的基因表达谱改变@肖献忠     

从热休克因子1基因敲除小鼠心肌组织中筛选应激反应中受热休克因子1调控的靶基因

采用cDNA芯片（上海博星公司，含15000个基因）分析了热休克因子1（HSF）基因敲除小鼠经热休克反应（42℃ 15min，恢复3h)后心肌组织中基因表达谱的改变，结果共筛选到差异表达基因1142个，其中在HSF^-／-小鼠心肌中表达下调的基因为501个，已命名基因为173个；在HSF^-/-小鼠心肌中表达上调的基因为641个，已命名基因为235个。对基因启动子区转录因子结合位点的分析发现，在HSF^-/-小鼠心肌中表达下调2．5倍的基因中，有Klf4和Sdrfl等5个基因启动子区含有完整的热休克元件（heat shock element,HSE);在HSF^-/-小鼠心肌中表达上调2．5倍的基因中，有Neul、Fgl2等6个基因启动子区含有完整的热休克元件，上述结果表明热休克因子1直接调控了这些基因的表达。本研究还采用生物信息学技术成功克隆了人XLHSRF1基因（GenBank ID:AY221994)及其大鼠同源基因。本实验在国际上首次从热休克因子1基因敲除小鼠心肌组织中筛选到应激反应中受热休克因子1调控的多个靶基因，为从基因水平进一步揭示热休克因子1在调节应激反应中的作用提供了新的信息。     

热休克预处理抗过氧化氢所致心肌细胞损伤保护作用的细胞分子机理

体外培养的鸡胚心肌细胞分别置于３７℃．３９℃．４２℃下进行预处理，ＳＤＳ－ＰＡＧＦ、Ｎｏｒｔｈｅｍｂｌｏｔ及Ｗｅｓｔｅｍｂｌｏｔ显示４２℃预处理２ｈ导致心肌细胞中热休克蛋白（ＨＳＰｓ）特别是ＨＳＰ７０基因表达明显增加，并明显减轻了随后Ｈ２Ｏ２所致的心肌细胞损伤，表现为较高的细胞存活率、较高的ＳＯＤ及过氧化氢酶活性及较低的ＴＢＡＲＳ水平，而３９℃２ｈ的热休克预处理未能获得上述结果。在转录抑制剂放线菌素Ｄ或翻译抑制剂放线菌酮存在下，热休克预处理所诱导的ＨＳＰ基因表达被完全阻断，上述心肌细胞保护作用亦被完全取消。本研究为热休克蛋白的心肌保护作用提供了进一步证据     

内毒素诱导小鼠腹腔巨噬细胞凋亡的机制探讨

细胞凋亡在形态学上表现为染色质浓缩,生长化学上则表现为核酸酶酶切ＤＮＡ。本研究试图探讨内毒素（脂多糖）诱导小鼠腹腔巨噬细胞凋亡的机制。结果显示,内毒素能诱导巨噬细胞凋亡,与对照组比,细胞吞噬机能显著下降（Ｐ〈０．０１）,腹腔灌洗液中ＮＯ２＾－／ＮＯ３＾－浓度显著升高。ＮＯ阻断剂ＡＧ和活性氧阻断剂ＰＤＴＣ均能部分抑制巨噬细胞凋亡,细胞吞噬机能也获得部分恢复。用ＬＰＳ和ＩＦＮ模拟在体情况,也能诱导培养     

过氧化氢对乳鼠心肌细胞核仁结构的损伤及HSP70的保护作用

目的采用体外培养的新生Wistar大鼠心肌细胞为模型,观察过氧化氢(H2O2)对心肌细胞核仁结构的损伤作用以及HSP70对核仁结构改变的保护作用.方法向体外培养的新生Wistar大鼠心肌细胞中加入含0.5mmol/LH2O2的无血清DMEM培基,观察3h后心肌细胞乳酸脱氢酶(LDH)的变化.采用甲苯胺兰(Toluidinblue)对核仁进行染色,光镜下观察核仁的结构变化,并采用电镜进一步观察核仁超微结构的改变.心肌细胞经42℃,30min热休克预处理(HSR)并恢复6h后,采用Westernblot及免疫组织化学方法观察HSP70在心肌细胞中的表达及应激状态下的分布变化.并观察HSR对H2O2所致LDH释放率及核仁结构变化的影响.经脂质体导入HSP70反义寡核苷酸以阻断HSP70的表达,观察其对热休克预处理保护作用的影响.结果0.5mmol/LH2O2引起心肌细胞LDH释放率明显升高(57.55%±3.18%vsCtrl8.93%±0.38%,P＜0.01),光镜下核仁染色颗粒数增多,电镜下核仁结构松散、核仁组份分离、碎裂.热休克预处理导致心肌细胞中HSP70表达明显增加,并使H2O2所致心肌细胞LDH释放率明显降低(21.68%±2.68%vsH2O257.55%±3.18%,P＜0.01)、核仁损伤明显减轻.免疫组化结果显示H2O2可引起HSP70从胞浆到胞核,再到核仁的移位.HSP70反义寡核苷酸的导入明显阻断了热休克预处理时HSP70的表达,并明显阻断了其对心肌细胞LDH释放率(43.70%±3.24%vsHSR±H2O221.68%±2.68%,H2O257.55%±3.18%,P＜0.01)及核仁损伤的保护作用.讨论H2O2可能通过引起蛋白质变性和聚集以及影响RNA聚合酶活性、rDNA模板活性,或者通过激活caspase-3系统,进而激活某些DNA或RNA核酸内切酶,从而导致核仁结构受损.应激时HSP70进入核仁以后,可能通过发挥其分子伴娘功能,与H2O2所致变性或聚集的RNA聚合酶、核糖核蛋白等结合,促使其复性或解聚,从而保证正常的细胞转录功能,维持核仁的正常结构;HSP70还可能在细胞浆内直接或间接抑制caspase-3的活化,或在核仁中与活化的caspase-3或其下游活化物结合而阻止caspase-3系统对核仁的损伤作用.上述结果提示H2O2可导致心肌细胞核仁结构损伤,HSP70表达及其向核仁的移位对上述损伤具有明显保护作用.     

热休克蛋白70对过氧化氢所致乳鼠心肌细胞核仁损伤的保护作用

为探讨氧化应激时体外培养的新生Wistar大鼠心肌细胞核仁损伤以及热休克蛋白70对损伤核仁的保护作用。用0.5mmol/L过氧化氢处理原代培养的心肌细胞0,30,60min，采用甲苯胺兰染色核仁及电镜技术观察核仁结构的改变；并通过热休克预处理及反义技术诱导或阻断热休克蛋白70的表达，观察其对核仁损伤的保护作用。结果发现，光镜下过氧化氢损伤组心肌细胞核仁染色颗粒数增多，电镜下核仁结构松散，核仁组份分离。热休克预处理导致心肌细胞中热休克蛋白70表达明显增加，并使过氧化氢缺致心肌细胞核仁损伤明显减轻，免疫组织化学显示过氧化氢可引起热休克蛋白70从胞浆到胞核，再到核仁的移位，热休克蛋白70反义寡核苷酸很大程度上能阻断热休克预处理对心肌细胞核仁损伤的保护作用。结果提示，过氧化氢可导致体外培养的新生大鼠心肌细胞核仁结构损伤，热休克蛋白70高表达及其向核仁的移位对上述损伤具有明显保护作用。