心肌组织特异性高表达核仁素转基因小鼠的构建与鉴定

 目的：构建并鉴定心肌组织特异性高表达核仁素(Ncl)的转基因小鼠,为从整体水平上研究核仁素对心肌功能的影响及其发挥心肌保护作用的机制提供动物模型。方法：采用基因重组法将小鼠核仁素基因的全长cDNA插入含心肌细胞特异性启动子的Alpha-MyHC clone 26载体,构建Alpha-MyHC clone 26-Ncl重组载体,通过双酶切及基因测序鉴定其正确性;采用PCR鉴定阳性小鼠并用Western blotting法观察转基因小鼠中核仁素的表达情况,采用组织切片及HE染色法观察转基因小鼠心肌组织形态;测量心脏重量指数和左室压最大上升速率,观察核仁素在心肌组织高表达后对小鼠心脏形态功能是否有影响。结果：PCR法观察显示获得4只阳性小鼠(51、52、56和86,其中52和86系繁殖良好）,Western blotting结果表明转基因小鼠的核仁素表达量明显高于野生鼠,HE染色等结果表明核仁素对心肌形态学、心脏/体重比值及心功能无明显影响。结论：成功制备了心肌组织特异性高表达核仁素的转基因小鼠,与野生型小鼠相比,转基因小鼠心肌形态及心功能无明显差异。     

一种快速分离C2C12细胞核仁的方法研究

[目的]探讨一种快速分离核仁且能保持其完整结构与功能的方法.[方法]采用低渗裂解分离细胞核,密度梯度离心分离细胞核仁,电镜、免疫印迹检测核仁的纯度.[结果]电镜检测发现在放大2 000倍时C2C12肌源细胞核仁呈现为大小基本一致、形态较为规则的黑色阴影,放大25 000倍时可见单个网孔状的核仁,且核仁各组分清晰可见.免疫印迹检测发现核仁纯度较高,没有胞浆蛋白的污染.[结论]本研究建立了一种快速分离细胞核仁的方法.     

过氧化氢对K562细胞凋亡的影响

目的 :探讨活性氧对K5 6 2细胞凋亡的影响。方法 :用过氧化氢 (hydrogenperoxide ,H2 O2 )作用于对数生长期的K5 6 2细胞。结果 :Hoechst 332 5 8染色法观察到K5 6 2细胞明显凋亡 ;caspase活性定量测定及WesternBlotting检测显示caspase 3, 8, 9同时被激活。结论 :H2 O2 可诱导K5 6 2细胞凋亡 ,且通过同时激活线粒体途径和死亡受体途径起作用。     

核仁素表达下调对C2C12细胞增殖与凋亡的影响

目的：探讨核仁素反义寡核苷酸对细胞增殖与凋亡的影响。方法：采用反义寡核苷酸技术以抑制C2C12细胞中核仁素的表达后,用MTT法检测细胞增殖状况,流式细胞术及DNA琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡。结果：免疫印迹结果显示,反义寡核苷酸导入细胞后24 h,核仁素的表达受到明显抑制,同时反义寡核苷酸处理组细胞的增殖能力亦明显受到抑制,细胞凋亡百分率显著升高,并能检测到清晰的“梯状条带”。而正义及随机核酸导入细胞后不能降低核仁素的表达,对细胞增殖及凋亡均无明显影响。结论：核仁素表达下调能抑制C2C12细胞增殖并能触发C2C12细胞凋亡。     

甘草素对人乳腺癌MCF-7细胞增殖、凋亡及自噬的影响

目的：观察甘草素对人乳腺癌MCF-7细胞生长、凋亡及自噬的作用。方法：不同浓度（0.05,0.10,0.20,0.40 mmol/L）的甘草素处理MCF-7细胞24,48,72 h后,采用MTT比色法测定细胞存活率。以上浓度的甘草素处理MCF-7细胞48 h后,用Hoechst荧光染色法观察细胞凋亡情况,用吖啶橙（AO）染色,观察细胞自噬。结果： 随着甘草素浓度的增加及作用时间的延长,MCF-7细胞的存活率不断降低,部分结果与对照组比较,差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01）;随着草素浓度的增加,MCF-7细胞的凋亡率不断增高,从0.20 mmol/L开始,与对照组比较,差异有统计学意义（均P<0.01）。各浓度的甘草素作用下,MCF-7细胞均产生自噬现象,但随着甘草素浓度的增加,自噬活性呈现先升后降的趋势。结论：甘草素可抑制人乳腺癌MCF-7细胞的生长,该作用与其促进凋亡及诱导自噬有关。

     

热休克转录因子1及其突变体的研究进展

热休克因子1（HSF1）是一种转录因子,在正常时不活化,应激时活化而具有反式激活能力。在其蛋白质结构中含有DNA结合域、三聚结构域、调节结构域、转录活化结构域等,它们在HSF1活化过程中各自发挥重要作用。通过改变HSF1的结构构建其突变体,能特异地引起或阻碍HSF1的活化。这些突变体已应用于心血管疾病、肿瘤、神经系统疾病的研究。     

热休克预处理抑制缺血-再灌注所致心肌细胞凋亡及其机制

目的：探讨缺血-再灌注所致心肌细胞凋亡发生的机制及热休克预处理抑制缺血-再灌注所致心肌细胞凋亡的机制。方法：采用结扎小鼠左冠状动脉制备在体小鼠心肌缺血-再灌注损伤（I/R）模型,经DNA ladder检测细胞凋亡,并检测caspase-3,caspase-8,caspase-9的活性。部分小鼠经热休克预处理后再进行上述实验。 结果：缺血-再灌注后心肌组织中出现DNA梯状条带,caspase-3,caspase-8,caspase-9活性显著增高;热休克预处理后,多种热休克蛋白（HSPs）表达增加,DNA片断化减轻及caspase的活性受到抑制。结论：缺血-再灌注损伤可激活膜死亡受体信号通路和线粒体信号通路,导致心肌细胞凋亡;通过诱导多种HSPs的表达,热休克预处理可抑制上述两条信号通路的活化和心肌细胞凋亡的发生。     

热休克预处理抑制过氧化氢所致心肌细胞Smac的释放及细胞凋亡

目的：探讨热休克预处理(heat shock pretreatment，HS)对过氧化氢(hydrogen peroxide，H2O2)所致心肌细胞凋亡及促凋亡分子线粒体释放的第二种Caspase激活物(the second mitochondria-deftved activator of easpases，Smac)从线粒体释放的影响。方法：①采用H2O2(0．5mmol／L)导致心肌细胞凋亡；②采用热休克预处理(42℃，1h，恢复12h)诱导热休克蛋白表达；③采用Hoechst荧光染色，观察细胞凋亡发生并计算凋亡核百分率；④采用easpase活性定量检测及Western-blotting观察caspase-3，9的活化；采用免疫荧光及Western-blotting检测细胞成分分离后Smac从线粒体的释放。结果：①H2O2处理2h，Smac从心肌细胞线粒体释放入胞浆；处理4hcaspase-3，9活性升高，12h达高峰；处理24h心肌细胞明显出现凋亡，凋亡核百分率明显升高；②热休克预处理可诱导心肌细胞中HSP90。HSP70及αB-晶状体蛋白的表达增高；抑制Smac释放、caspase-3，9的活化及细胞凋亡的发生。结论：线粒体信号通路在H2O2所致的心肌细胞凋亡中发挥重要作用；热休克预处理通过抑制上述通路而减轻H2O2所致的细胞凋亡，其机制与其诱导热休克蛋白表达、阻断Smac从线粒体向胞浆释放、抑制caspase-3，9的活化有关。     

热休克预处理抑制过氧化氢所致心肌细胞Smac的释放及细胞凋亡

目的 :探讨热休克预处理 (heatshockpretreatment,HS)对过氧化氢 (hydrogenperoxide ,H2 O2 )所致心肌细胞凋亡及促凋亡分子线粒体释放的第二种Caspase激活物 (thesecondmitochondria derivedactivatorofcaspases ,Smac)从线粒体释放的影响。方法 :①采用H2 O2 (0 .5mmol/L)导致心肌细胞凋亡 ;②采用热休克预处理 (4 2℃ ,1h ,恢复 12h)诱导热休克蛋白表达 ;③采用Hoechst荧光染色 ,观察细胞凋亡发生并计算凋亡核百分率 ;④采用cas pase活性定量检测及Western blotting观察caspase 3,9的活化 ;采用免疫荧光及Western blotting检测细胞成分分离后Smac从线粒体的释放。结果 :①H2 O2 处理 2h ,Smac从心肌细胞线粒体释放入胞浆 ;处理 4hcaspase 3,9活性升高 ,12h达高峰 ;处理 2 4h心肌细胞明显出现凋亡 ,凋亡核百分率明显升高 ;②热休克预处理可诱导心肌细胞中HSP90 ,HSP70及αB 晶状体蛋白的表达增高 ;抑制Smac释放、caspase 3,9的活化及细胞凋亡的发生。结论 :线粒体信号通路在H2 O2 所致的心肌细胞凋亡中发挥重要作用 ;热休克预处理通过抑制上述通路而减轻H2 O2 所致的细胞凋亡 ,其机制与其诱导热休克蛋白表达、阻断Smac从线粒体向胞浆释放、抑制caspase 3,9的活化有关。     

基础医学本科教学质量工程的建设与成效

实施基础医学本科教学质量工程的建设,在师资培养、课程建设、实验教学、教学内容、方法、管理等方面进行了探讨,取得了显著成效。