双向电泳联合免疫印迹技术分析日本血吸虫成虫可溶性抗原

目的建立及优化日本血吸虫成虫的蛋白质组学分析方法,寻找可溶性蛋白组分中与免疫应答相关的特异性成虫抗原。方法纯化日本血吸虫成虫可溶性蛋白,应用双向电泳（2D—E）结合免疫印迹技术（Western blotting）,获得相应的电泳图谱和免疫印迹图谱,应用PDQuest 8．0双向电泳图像分析软件对图像进行分析比对,鉴别特异性抗原。结果血吸虫成虫可溶性蛋白经双向电泳后,考马斯亮蓝G250染色,电泳图谱显示约152个主要蛋白斑点。分子量（Mr）分布约为14～114kD;等电点（pI）主要集中在4．9～9．5。进一步的Western blotting鉴定结果显示：实验组图像可见的抗原抗体反应点数目约57个,对照组为0。结论双向电泳联合免疫印迹技术是成功分析蛋白质组学的技术关键,该技术为寻找日本血吸虫特异性抗原开辟了新途径。     

血浆 DNA 浓度对急诊重症监护室休克患者预后的预测价值

目的：探讨血浆DNA浓度对急诊重症监护室（ EICU ）休克患者病情及预后的预测价值。方法采用前瞻性、随机对照方法,选择2012－06～2013－12期间入住我院EICU休克患者共69例,分别于入室0、24 h采取外周静脉血,应用实时荧光定量PCR技术定量检测血浆DNA浓度,同时测定血乳酸,以及24 h内急性生理学和慢性健康状况评分Ⅱ（ APACHEⅡ评分）;另选取30例体检者为健康对照组。随访28天生存率,比较28天存活组和死亡组之间不同时相点血浆DNA、乳酸浓度以及24 h APACHEⅡ评分对病情及预后的评估价值。结果患者入室0 h血浆DNA浓度7.66×105（1.61×105～2.06×106） pg／mL和24 h血浆DNA浓度3.91×105（3.47×104～3.88×106）pg／mL,均明显高于健康对照组[9.09×103（4.77×103～8.97×104）pg／mL,P＜0.05]。入室0、24 h存活组与死亡组患者血浆DNA浓度分别为2.85×105（7.20×104～9.35× 105）pg／mL vs 1.91×106（7.81×105～4.60×107）pg／mL、5.74×104（1.12×104～5.97×105）pg／mL vs 3.82×106（1.66×106～9.27×106）pg／mL,差异均有统计学意义（P＜0.05）。入室0 h的血浆DNA曲线下面积为0.822 （ 0.707～0.937）,特异度为71.9％,敏感度为75％,最佳截断值为8.11×105 pg／mL;入室24 h的血浆DNA曲线下面积为0.861（0.759～0.963）,特异度为87.5％,敏感度为80％,最佳截断值为1.39×106 pg／mL。多元Logistic回归分析显示,24 h血浆DNA和24 h血乳酸分别是预测休克患者28天死亡率的独立危险因素。结论入室24 h血浆DNA和24 h血乳酸可作为判断休克患者的独立预测因子,且血浆DNA预测价值明显高于乳酸。     

携带Foxp3基因慢病毒载体的构建

目的构建携带叉头样转录因子p3（Foxp3）基因的重组慢病毒载体PWPXL-MOD-Foxp3,并包装成慢病毒,为体外获得CD4＋CD2＋5调节性T细胞（CD4＋CD2＋5 Tregs）奠定基础。方法采用双酶切法构建慢病毒表达载体PWPXL-MOD-Foxp3,用磷酸钙沉淀法将包装慢病毒所需的四质粒系统共转染人胚肾细胞293T,慢病毒系统转染48h后收集病毒上清液,纯化、浓缩后采用流式细胞术测定慢病毒滴度。结果重组的慢病毒载体滴度为3.3×108IU/ml。结论成功构建了含有Foxp3基因的高滴度的慢病毒载体,为体外获得CD 4＋CD 2＋5 Tregs奠定基础。     

弓形虫ROP18重组腺病毒载体的构建及其对神经干细胞C17.2凋亡的影响

目的 构建弓形虫棒状体蛋白ROP18重组腺病毒载体,研究其对神经干细胞C17.2凋亡的影响.方法 将弓形虫ROP18从PEGFP-G2-ROP18重组质粒上亚克隆至腺病毒载体pHBAd-MCMV-GFP,重组腺病毒载体pHBAd-MCMV-GFP- ROP18经PCR,测序鉴定正确后,与骨架质粒pHBAd-BHG共转染HEK293细胞进行包装,收获,扩增重组腺病毒并对其滴度进行测定.以MOI=70的重组腺病毒感染神经干细胞C17.2,转染不同时间荧光显微镜观察基因的表达情况.转染48 h用CCK-8法检测C17.2的增殖情况;转染24 h采用Annexin V-APC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡情况;Western blot法检测半胱天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)的蛋白水平.结果 重组ROP18过表达腺病毒在C17.2神经干细胞内能有效表达.转染48 h,与空载体对照组相比,C17.2细胞增殖活性明显降低(P<0.05);转染24 h,流式细胞术检测结果显示,ROP18基因转染组C17.2细胞凋亡率明显增加(P<0.001);Western blot检测显示caspase-3活性片段的表达明显增加(P<0.05).结论 成功构建了弓形虫ROP18重组腺病毒并在神经干细胞C17.2中表达,ROP18重组腺病毒能诱导C17.2神经干细胞凋亡.     

重组日本血吸虫26 ku谷胱甘肽-硫-转移酶的表达、纯化及其免疫特性分析用于急性血吸虫病免疫诊断

目的将日本血吸虫(中国大陆株)26 ku谷胱甘肽-硫-转移酶(26 ku SjGST)基因克隆入pET28a(+)并诱导表达26 ku rSjGST蛋白,纯化并用于急性血吸虫病免疫诊断.方法构建重组质粒pET28a-SjGST,转化到E.coli BL21,经IPTG诱导表达并进行SDS变性蛋白质电泳,以小鼠抗GST单克隆抗体为一抗,进行Western-blot分析.用His·BandPurification Kit亲和层析纯化重组蛋白,以此重组蛋白作为抗原,用ELISA法检测急性血吸虫患者血清和非流行区正常人血清. 结果成功地构建了重组质粒pET28a-SjGST,SDS变性蛋白质电泳显示可见一与预期分子量大小相符的特异蛋白条带的表达.Western blot分析表明,该重组蛋白能被小鼠抗GST单克隆抗体识别.ELISA结果表明,rSj GST用于急性血吸虫患者血清中抗体检测的阳性率为92.3%.结论 rSj GST得到表达和纯化,该重组蛋白用于急性血吸虫患者血清中抗体的检测具有良好的免疫反应性,为进一步探讨其在血吸虫病诊断中的应用奠定了基础.     

食管癌患者化疗前后ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈ调节性Ｔ细胞及Ｆｏｘｐ３ｍＲＮＡ的表达及其临床意义

目的：探讨晚期食管癌患者化疗前后外周血中ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈ调节性Ｔ细胞及Ｆｏｘｐ３ｍＲＮＡ的表达变化及其临床意义。方法：采用流式细胞术检测６８例晚期食管癌患者化疗前后外周血ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈ调节性Ｔ细胞的水平,并与４０例健康成人进行比较。同时运用ＲＴ-ＰＣＲ方法检测其中４０例患者化疗前后外周血调节性Ｔ细胞Ｆｏｘｐ３基因ｍＲＮＡ的表达情况。结果：（１）食管癌患者外周血中ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈ调节性Ｔ细胞占ＣＤ４＋Ｔ细胞总数的（１.８２±０.５４）％,显著高于健康对照组的（１.５２±０.７０）％（Ｐ＜０.０１）;（２）化疗前患者外周血中ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈ调节性Ｔ细胞为（１.８２±０.５４）％,明显高于化疗后的（１.６６±０.５８）％（Ｐ＜０.０5）;（３）化疗前患者调节性Ｔ细胞Ｆｏｘｐ３基因ｍＲＮＡ的相对表达量为０.３１８±０.０２７,明显高于化疗后的０.２６６±０.０２８（Ｐ＜０.０５）。结论：食管癌患者接受化疗后外周血中Ｆｏｘｐ３ｍＲＮＡ水平与ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈ调节性Ｔ细胞数量表达均显著下降,推测Ｆｏｘｐ３基因可能对ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈＴ细胞有重要的调节功能,从而影响食管癌患者化疗后ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈ调节性Ｔ细胞的水平。     

大鼠表皮生长因子、睫状神经营养因子真核表达载体的构建及其体外表达的鉴定

背景：星形胶质细胞被激活后表现出神经干细胞的特性,细胞表面的神经营养因子(表皮生长因子、睫状神经营养因子)受体超表达,通过改善复杂的内环境,有利于定向诱导神经干细胞向神经元的分化。 目的：构建大鼠pSecTag2/Hygro B-EGF、pSecTag2/Hygro B-CNTF真核表达质粒,检测其在cos-7细胞中的共表达。 方法：采用反转录-聚合酶链反应技术从大鼠颌下腺、坐骨神经组织总RNA中扩增出表皮生长因子、睫状神经营养因子基因功能区,将上述基因片段分别连接到真核表达载体pSecTag2/Hygro B,聚合酶链反应初步筛选、双酶切鉴定后送测序。将构建成功的两种重组载体单独及共转染cos-7细胞,Western blot法鉴定重组表皮生长因子、睫状神经营养因子蛋白的瞬时表达。 结果与结论：反转录-聚合酶链反应结果证实成功获得大鼠表皮生长因子、睫状神经营养因子cDNA。DNA序列分析证实2种真核表达载体中的表皮生长因子、睫状神经营养因子序列与GenBank中目的序列一致。脂质体介导转染cos-7细胞48 h后,Western blot鉴定重组表皮生长因子、睫状神经营养因子蛋白在cos-7细胞中的表达,分别在Mr6 000,22 000处出现阳性条带。提示大鼠表皮生长因子、睫状神经营养因子基因的真核表达载体pSecTag2/Hygro B-EGF、pSecTag2/Hygro B-CNTF构建成功,共转染cos-7细胞后能够共表达重组表皮生长因子、睫状神经营养因子蛋白。     

芍药苷对血吸虫肝纤维化小鼠肿瘤坏死因子α基因及蛋白水平的影响

目的从血清、基因、蛋白表达水平探讨小鼠感染血吸虫后肝纤维化不同时期给予芍药苷治疗对肝组织肿瘤坏死因子ct（TNF-α）的影响。方法除正常组（Ⅳ组）外,将BALB／C小鼠随机分为杀虫前（I组）、杀虫同时（Ⅱ组）及杀虫后给药组（Ⅲ组）,I组于感染12d开始给予芍药苷和溶剂媒,Ⅱ组于感染42d给药,Ⅲ组于感染72d给药,均用药30d,所有感染小鼠于42d以吡喹酮杀虫,用药结束后60d处死小鼠,取血和肝脏。采用放免法、RT—PCR法、Western—blotting法和免疫组化法分别观测血清及肝组织中TNF—α转录和表达情况。结果芍药苷可显著降低血清及mRNA水平的TNF—α表达;而在Western—blotting法和免疫组化法中,仅在I组和Ⅲ组,芍药苷明显降低TNF—α的含量。结论TNF—α与肝纤维化呈正相关。芍药苷可抑制虫卵肉芽肿,减少胶原生成,TNF-α水平也相应降低。     

弓形虫RH株ROP16I/III基因缺陷虫株感染BALB/c鼠的致病性研究

目的 旨在深入研究弓形虫棒状体效应分子ROP16与虫株毒力及致病性的关系。方法 采用弓形虫ROP16_I/III基因敲除RH株(RH_ΔROP16)攻击感染BALB/c小鼠,在感染后不同时间点与野生株感染鼠比较,动态观察感染动物发病症状、存活时间; HE染色观察脑组织、肺组织病理学差异,qRT-PCR检测脾细胞炎性及抑炎细胞因子表达水平。结果 两组小鼠的发病症状无明显差异;经HE染色显微镜下观察小鼠肺部及脑部病理学改变亦未见无明显差异;qRT-PCR检测并用Graph pad分析两组虫株感染小鼠的脾细胞Arg-1、IL-10、IL-12、TNF -α及IFN-γ等细胞因子表达水平。数据表明在感染相同时间ROP16缺陷株感染小鼠Arg-1的表达量明显低于野生型虫株(P< 0.05);而IL-10、IL-12、TNF-α和IFN -γ的表达水平无统计学差异(P> 0.05)。结论 I型弓形虫RH株的ROP16_I/III并非是决定急性感染期弓形虫毒力的唯一效应分子;ROP16_I/III可诱导宿主Arg-1高表达,提示与巨噬细胞内虫体的增殖有关。     

日本血吸虫信号蛋白14-3-3在虫卵的定位及其免疫诊断价值初探

目的探讨日本血吸虫信号蛋白14—3—3（sj14—3—3）在虫卵内的定位和重组Sj14—3-3（rsj14—3—3）的免疫诊断价值。方法从日本血吸虫尾蚴感染42d的兔肝脏中分离虫卵，用逆转录聚合酶链反应（1it—PCR）检测sj14．3．3基因在虫卵期的转录水平；兔肝组织石蜡切片免疫组化染色，观察内源性Sj14—3—3在虫卵内的分布和表达丰度。利用纯化的rSj14-3-3和可溶性虫卵抗原（SEA），采用间接酶联免疫吸附试验（ELISA）检测急、慢性血吸虫病患者和正常人血清。结果RT-PCR从日本血吸虫成熟虫卵中检出760bp左右的基因片断；免疫组化显示Sj14-3-3主要分布在虫卵内毛蚴的体壁和两边的侧腺。检测急性、慢性患者和正常人血清抗rSj14-3—3抗原的抗体阳性率分别为91．0％、78．9％、0．0％；上述标本中抗SEA抗体的阳性率分别为97．4％、88．9％和2．5％。结论用ELISA检测抗SEA抗体和rSj14-3-3抗体诊断血吸虫病具有高度的特异性和敏感性，而Sj14—3-3在成熟虫卵阶段高表达，可能是SEA的主要组分，具有实用价值。