热休克蛋白90抑制剂格尔德霉素对人肝癌BEL7404细胞株凋亡作用的研究

目的:研究热休克蛋白90 (heat shock protein 90,HSP90)抑制剂格尔德霉素(geldanamycin,GA)对人肝癌细胞株BEL7404的凋亡作用,并探讨其用于肝癌治疗的可行性.方法:体外培养BEL7404细胞株,以GA作用处理;噻唑兰比色(MTT)法检测GA对BEL7404细胞株的增殖抑制作用;吖啶橙荧光染色法及Annexin V-EGFP/PI双染法、透射电镜等方法研究GA对BEL7404细胞株的凋亡作用;流式细胞仪检测BEL7404细胞株的细胞周期变化.结果:GA对BEL7404细胞株具有增殖抑制作用,呈时间剂量依赖关系;GA各剂量组作用24 h凋亡率均明显高于阴性对照组(6.31±0.82)%;流式细胞仪检测各剂量组GA均可使BEL7404细胞株细胞周期阻滞于G0/G1期.结论:抑制HSP90的功能可引起肝癌细胞增殖抑制和凋亡,HSP90有可能成为肝癌治疗的新靶点.     

精子蛋白32(sp32)/OY-TES-1在生精细胞中的分布及其抗体的血清学检测

目的:了解精子蛋白(sperm protein32,sp32)/OY-TES-1蛋白在生精细胞中的分布及抗sp32/OY-TES-1抗体在不育症患者血清中的出现情况。方法:用重组表达的OY-TES-1麦芽糖融合蛋白免疫新西兰白兔,制备sp32/OY-TES-1多克隆抗体,且经纯化鉴定后用于检测人精子和大鼠正常睾丸组织;用ELISA试验,检测不育症患者和正常人血清中抗sp32/OY-TES-1抗体。结果:①免疫后的兔血清含高效价的sp32/OY-TES-1多克隆抗体,并可与OY-TES-1麦芽糖融合蛋白特异性地结合;②免疫组化染色显示人精子头部、大鼠精子和精子细胞中呈免疫反应阳性。③ELISA检测结果显示76例正常人血清中无抗sp32/OY-TES-1抗体,而不育症患者血清其抗体的阳性率高达70.77%(46/65),并有较高的抗体水平。结论:本实验制备的sp32/OY-TES-1多克隆抗体可用于大鼠睾丸生殖细胞的检测,为后续用大鼠进行sp32/OY-TES-1的相关研究奠定了基础。sp32/OY-TES-1特异性地表达于精子细胞和精子,其抗体的出现意义与不育症的关系有待进一步研究。     

Tumstatin肽对视网膜微血管内皮细胞迁移及P38MAPK蛋白表达的影响

目的:观察tumstatin肽对体外培养的视网膜微血管内皮细胞迁移及P38MAPK蛋白表达的影响,初步探讨tumstatin肽抗视网膜内皮细胞迁移的机制。方法:采用细胞划痕实验测定tumstatin肽(T8肽)对血管内皮生长因子(VEGF)诱导下RF/6A细胞(恒河猴视网膜微血管内皮细胞)迁移的影响;Western blotting检测T8肽对VEGF刺激后15,30,45,60min的RF/6A细胞P38MAPK蛋白水平的变化。结果:Tumstatin肽对RF/6A细胞迁移具有抑制作用,且可抑制VEGF对RF/6A细胞的促迁移作用,呈剂量依赖性。正常情况下,RF/6A细胞无P38MAPK蛋白的表达,但VEGF可诱导其表达P38MAPK蛋白,而tumstatin可抑制VEGF诱导的RF/6A细胞P38MAPK蛋白的表达(加入20mg/LT8肽30,45,60min时蛋白表达受到显著抑制,差异有显著性意义,P<0.01)。结论:Tumstatin抑制视网膜微血管内皮细胞的迁移,其作用可能与P38MAPK通路有关。     

Tumstatin肽对视网膜微血管内皮细胞增殖及ERK蛋白表达的影响

目的 观察Tumstatin肽对体外培养的视网膜微血管内皮细胞增殖及细胞外信号调节激酶(ERK) 蛋白表达的影响。方法　采用MTT比色法测定Tumstatin肽（T8肽）对血管内皮生长因子（VEGF）诱导下的恒河猴视网膜血管内皮细胞（RF/6A细胞）增殖的干预作用；采用Western-blot检测T8肽对VEGF刺激后15min、30min、45 min和60min的RF/6A细胞ERK1/2蛋白表达水平的变化。 结果　T8肽浓度在5μg/ml 以上时对RF/6A细胞有抑制作用，且抑制作用随着浓度的增大而增高，各组OD值和抑制率比较差异均有显著性意义（P均<0.05）；T8肽可抑制VEGF对RF/6A细胞的促增殖作用；在1～40μg /ml相同浓度条件下，T8肽对VEGF条件下的RF/6A细胞增殖抑制率显著大于无VEGF条件下的抑制率（P均<0.01）。VEGF可刺激RF/6A细胞ERK1/2蛋白表达增加，T8肽可抑制VEGF诱导的RF/6A细胞ERK1/2蛋白的表达。 结论　Tumstatin抑制视网膜微血管内皮细胞的增殖，机制可能与VEGF信号转导通路上的ERK1/2细胞信号转导通路有关。     

大鼠视网膜Müller细胞的培养与鉴定

目的：仿照前人建立的方法，优化SD大鼠视网膜Müller细胞体外培养的技术和方法，为后续相关研究建立实验室条件。方法：使用胰蛋白酶消化的方法分离新生SD大鼠视网膜Müller细胞，以DMEM为培养基体外培养，光镜观察。采用电镜观察及荧光免疫组织化学染色的方法进行鉴定。结果：培养的细胞贴壁生长，原代细胞胞体狭长，细胞质丰富，折光性好。电镜下可见特征性的中间丝（直径8～10nm），细胞器丰富；荧光免疫组织化学显示细胞呈神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和谷氨酰胺合成酶（GS）阳性。结论：酶消化法培养SD大鼠视网膜Müller细胞是一种稳定、可靠的方法。     

大鼠视网膜Müller细胞的培养与鉴定

目的:仿照前人建立的方法,优化SD大鼠视网膜Müller细胞体外培养的技术和方法,为后续相关研究建立实验室条件.方法:使用胰蛋白酶消化的方法分离新生SD大鼠视网膜Müller细胞,以DMEM为培养基体外培养,光镜观察.采用电镜观察及荧光免疫组织化学染色的方法进行鉴定.结果:培养的细胞贴壁生长,原代细胞胞体狭长,细胞质丰富,折光性好.电镜下可见特征性的中间丝(直径8～10 nm),细胞器丰富;荧光免疫组织化学显示细胞呈神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和谷氨酰胺合成酶(GS)阳性.结论:酶消化法培养SD大鼠视网膜Müller细胞是一种稳定、可靠的方法.