电磁场干预大鼠骨髓间充质干细胞向心肌方向诱导分化的研究

【目的】观察脉冲电磁场（PEMFs）对5-氮胞苷（5-aza）诱导大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）向心肌样细胞分化的影响。【方法】50Hz脉冲低频电磁场刺激5-aza诱导7d后的MSCs,根据不同的感应强度和作用的时间分为A、B、C组和1、2、3、4亚组,设未暴露PEMFs的为对照组。通过Western印迹法检测不同条件下心肌肌钙蛋白T的变化。【结果】0．5、1和5mT组中20min、30min各亚组cTnT的表达量较对照组,5mT组在10min的表达量减少。【结论】50Hz的0．5～5mT感应强度的PEMFs作用20～30min为促进体外5-aza诱导MSCs向心肌方向的分化的有效窗口。     

RNA干扰her2／neu基因表达抑制肺癌A549细胞增殖的研究

目的:HER2/neu表达对肺癌细胞生物学的影响尚不明了,文中运用RNA干扰技术抑制HER2/neu表达,并观察对肺癌A549 细胞体外增殖的影响.方法:构建针对her2/neu基因的RNA干扰真核表达载体,运用脂质体介导转染A549 细胞并用G418筛选出阳性克隆株;半定量RT-PCR和Western检测转染后HER2/neu mRNA及蛋白的表达水平;FCM检测细胞周期分布; MTT法绘制细胞生长曲线观察体外细胞的增值能力.结果:成功构建针对her2/neu基因的RNA干扰真核表达载体(命名为psilence 3.1-HER2),转染后使A549 细胞HER2/neu mRNA和蛋白的表达较未转染组和阴性对照质粒转染组均显著下调;细胞G0/G1期细胞增加,S期细胞减少;细胞生长曲线右移、增殖速度明显减慢.结论:psilence 3.1-HER2能够稳定、高效、特异地抑制肺癌A549内her2/neu基因的表达,可显著抑制细胞增殖.针对her2/neu基因的RNAi策略有望成为肺癌的基因治疗的新选择.     

家兔烧伤早期内脏血管内皮细胞损伤的变化

血管是烧伤早期受损最明显的器官之一，研究血管内皮细胞损伤对了解多器官功能衰竭（ＭＯＦ）形成的机理，提高大面积烧伤的救治率都将具有指导意义。选本地雄性家兔２６只，分正常、６ｈ、１２ｈ、２４ｈ、４８ｈ五组，制成３０％总体表面积（ＴＢＳＡ）Ⅲ度烧伤模型。观察了血浆胶体渗透压、循环内皮细胞（ＣＥＣ）、血清血管紧张素转换酶（ＡＣＥ）活性、血浆髓过氧化物酶（ＭＰＯ）活性，以及心、肾、肠、肝、肺中ＡＣＥ和ＭＰＯ     

细胞骨架肌动蛋白表达质粒转染内皮细胞不同方法的比较

目的　筛选适合于人脐静脉内皮细胞的转染方法 ,为进一步转染其他目的基因打下基础。　方法　以质粒pEGFP Actin为外源性基因 ,分别用脂质体介导的转染法、DEAE 葡聚糖转染法和电穿孔转染法转染人脐静脉血管内皮细胞 (ECV 30 4 )。比较转染后的细胞死亡率和细胞转染率。　结果　 (1) 3种不同方法转染后 12h ,细胞死亡率均为 4 % ,至 6 0h时DEAE 葡聚糖转染的细胞死亡率上升至 5 0 %。 (2 ) 3种方法均能使ECV 30 4获得 95 %的转染率 ,脂质体介导的转染法荧光强度强于电穿孔转染法。　结论　脂质体转染法和电穿孔转染法用于ECV 30 4 ,有较好的稳定性和重复性 ,可作为研究外源性蛋白作用于内皮细胞分子机制的技术手段     

端粒酶催化亚单位基因转染对人胚胎成纤维细胞表型及寿命的影响

目的探讨外源性人端粒酶蛋白催化亚单位(hTERT)基因转染对人胚胎成纤维细胞(hEFs)寿命的影响以及基因转染后细胞是否存在恶性表型。方法应用脂质体法将pIRES2-EGFP-hTERT正义重组质粒及pIRES2-EGFP空载质粒分别导入原代培养hEFs,Westernblot检测hTERT蛋白及I、III型胶原表达。染色体核型分析、裸鼠皮下致瘤性实验、DNA倍体实验以及形态学观察分析转染细胞是否存在恶性表型。结果外源性hTERT基因转染的胚胎成纤维细胞hTERT蛋白和I、III型胶原表达增加,体外传代次数增加,传至75代仍保持以2d的倍增周期生长,并且染色体仍为23对,均为正常二倍体细胞;裸鼠皮下不具有成瘤的能力;而hEFs和空载转染细胞传至60代左右平均五六天传代1次,出现生长停滞现象。结论外源性hTERT基因转染使胎儿成纤维细胞增殖旺盛,寿命延长,且不具有恶性表型。     

富组蛋白1对人表皮细胞株HaCaT增殖和迁移功能的影响

目的 了解富组蛋白1( Hst1)对人表皮细胞株HaCaT增殖、迁移功能的影响. 方法 (1)常规培养HaCaT细胞,按照随机数字表法(分组方法下同)分为对照组与100、30、3μg/mL Hst1组以及10 ng/mL重组人表皮生长因子(rhEGF)组、30 μg/mL Hst1+ 10 ng/mL rhEGF组,每组样本数为27.对照组不添加刺激因素,后5组分别加入相应浓度Hst1和(或)rhEGF,培养24、48、72 h采用细胞计数法检测各组细胞增殖水平.(2)将HaCaT细胞分为对照组与100、30、3μg/mL Hst1组,每组样本数为27.对照组不添加刺激因素,后3组分别加入相应浓度Hst1,培养24、48、72 h采用流式细胞术检测各组细胞周期,计算增殖指数(PI).(3)将HaCaT细胞分为对照组、30 μg/mL Hst1组、10 ng/mL rhEGF组、30 μg/mL Hst1+10 ng/mL rhEGF组、15 μg/mL Hst1+5 ng/mL rhEGF组、15 iμg/mL Hst1+ 10 ng/mL rhEGF组,每组样本数为10.对照组不添加刺激因素,后5组分别加入相应浓度的Hst1和(或)rhEGF培养.将各组细胞分为2份,一份用丝裂霉素C处理2h,另一份不作处理,均行划痕实验,划痕后0(即刻)、16、24 h观测细胞迁移情况并计算划痕愈合面积百分比.对数据行方差分析、LSD-t检验或Dunnettt检验. 结果 (1)培养24 h,10 ng/mL rhEGF组、30 μg/mLHst1+ 10 ng/mL rhEGF组细胞数显著高于对照组(t值分别为3.813、5.410,P＜0.05或P＜0.01).与培养48 h时30、3 μg/mL Hst1组比较除外,其余各Hst1和(或)rhEGF处理组培养48、72 h细胞数均显著高于对照组(t值为7.754～24.979,P值均小于0.01).培养72 h,100 μg/mL Hst1组细胞数为(19.21±0.59)×104个,明显高于30 μg/mL Hst1组的(16.19±0.53) ×104个及3 μg/mL Hst1组的(15.38±0.13)×104个(t值分别为11.391、19.017,P值均小于0.01);30.μg/mLHst1+ 10 ng/mLrhEGF组细胞数高于30、3μg/mL Hst1组及10 ng/mL rhEGF组(t值为4.579 ～34.884,P＜0.05或P ＜0.01).各组细胞数均随培养时间的延长而增加.(2)与对照组培养24、48 h比较,100、30 μg/mL Hst1组G0/G1期细胞百分比降低,S期细胞百分比提高(30 μg/mL Hst1组与对照组培养24 h比较除外),PI值显著提高(t值为4.752 ～16.104,P值均小于0.01).3μg/mL Hst1组仅在培养48 h时PI值较对照组显著增加(t=4.609,P＜0.01).培养72 h,仅100 μg/mL Hst1组PI值显著高于对照组(t =8.005,P＜0.01).各Hst1处理组组间比较,各时相点随Hst1浓度降低,G0/G1期细胞百分比呈升高趋势,S期细胞百分比及PI值均呈下降趋势.各Hst1处理组组内比较,随着培养时间的延长,G0/G1期细胞百分比先降低后增加,S期细胞百分比、PI值均先增加后降低.(3)未用丝裂霉素C处理:划痕后16h,30 μg/mL Hst1组划痕愈合面积百分比为(75.9±3.9)％,显著高于对照组、10 ng/mL rhEGF组[(53.0±3.5)％、(61.7±2.5)％,t值分别为12.241、7.598,P值均小于0.01],低于30 μg/mL Hst1+10 ng/mL rhEGF组、15 μg/mL Hst1+5 ng/mL rhEGF组、15 μg/mLHst1+ 10 ng/mL rhEGF组[(95.0±4.1)％、(97.0±3.7)％、(80.5±5.9)％,t值为-11.324～-2.502,P＜0.05或P＜0.01].丝裂霉素C处理:划痕后16h,30 μg/mL Hst1组划痕愈合面积百分比为(54.1±4.5)％,高于对照组[(35.8±5.7)％,t =7.790,P＜0 01],但较未用丝裂霉素C处理时明显下降(t=- 10.863,P＜0.01);与其他Hst1和rhEGF联合处理组相近(t值为0.061 ～2.030,P值均大于0.05).未用丝裂霉素C处理时及丝裂霉素C处理后各组内划痕后24 h与16 h划痕愈合面积百分比相近(F值为0.856～3.062,P值均大于0.05). 结论 Hst1能促进HaCaT细胞增殖和迁移,与rhEGF联合应用时对细胞增殖有协同促进作用,但对细胞迁移无明显协同作用.     

大鼠烧伤早期血浆内皮素变化及其对内皮细胞通透性的影响

为探讨烧伤早期内皮素变化及不同浓度ET-1对培养血管内皮细胞通透性的影响,动态观察了大鼠30％Ⅲ度烧伤早期血浆内皮素变化规律及其对内皮细胞通透性的直接影响。结果表明:血浆ET浓度伤后迅速升高,6小时达峰值,以后虽有所回落,但24小时内仍显著高于基础水平(P<0.01);培养血管内皮细胞单层与0,1,10,100nmol/L ET-1孵育后,其对Hank’s液或白蛋白灌注液的滤过流量、滤过系数均明显增加,而对蛋白渗透压反射系数显著减少,且存在剂量依赖性。提示烧伤后异常增高的ET除发挥其强大的缩血管作用,调节血流分布外,还直接促进了烧伤后毛细血管通透性的增加。     

CD11/CD18在烧伤早期中性粒细胞对内皮细胞粘附中的作用及变化

为了解烧伤早期病人中性粒细胞(PMN)膜表面 CD11a/CD18和 CD11b/CD18变化规律及其在烧伤早期 PMN 对内皮细胞(EC)粘附及损伤中的作用,为临床抗白细胞粘附治疗提供依据。将烧伤早期 PMN 与体外培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)孵育24小时后,观察烧伤早期 PMN 与 EC 粘附百分率和烧伤早期 PMN 引起内皮细胞单层流出液生成速度(Jv)和滤过系数(kf)变化,CD11/CD18单抗(mAb)对烧伤早期 PMN-EC 粘附和内皮单层 kf、Jv 值影响。并应用流式细胞术检测烧伤病人伤后1周内 PMN 膜表面 CD11a/CD18和 CD11b/CD18的数量变化。结果显示严重烧伤病人伤后第1天 PMN细胞膜表面 CD11a/CD18和 CD11b/CD18明显升高达峰值,并在1周内仍维持于高水平。烧伤早期PMN 与 EC 粘附增加并可致内皮单层 kf、Jv 值明显升高,CD11a/CD18mAb 和 CD11b/CD18mAb 可降低粘附百分率70%～80%,并降低烧伤早期 PMN 诱导增高的内皮单层 kf、Jv 值(P<0.01)。提示烧伤后 PMN 迅速表达 CD11a/CD18和 CD11b/CD18,加强与 EC 间粘附,并可使内皮单层通透性增高,CD11a/CD18mAb 和 CD11b/CD18mAb 降低烧伤早期 PMN 与 EC 粘附,减轻烧伤早期 PMN 所导致的内皮单层通透性增高,从而保护内皮细胞。     

严重烧伤早期粘附分子的表达对中性粒细胞在肝脏中聚集的影响

目的研究严重烧伤后早期中性粒细胞在肝脏中的聚集机制及相关粘附分子表达的变化。方法采用动物实验大体标本进行肝组织观察和检测,人肝细胞、肝窦内皮细胞和中性粒细胞培养,并利用微管吸吮系统,流式细胞术,以及细胞间粘附分子-1(CAM-1)单抗的应用,观察了烧伤病人(烧伤面积50％以上,Ⅱ～Ⅲ度48小时内)血清对 P-选择素和 ICAM-1在两种细胞中表达的影响,两细胞间粘附力的变化及 ICAM-1单抗的影响。结果①烧伤后各时相点肝组织中髓过氧化物酶明显增高,形态学观察有中性粒细胞聚集;②在正常血清培养下未检测到肝细胞表面 P-选择素和 ICAM-1,烧伤血清作用后从1小时开始检测到 ICAM-1增多(P<0.05),6小时达到高峰(P<0.01),以后仍维持在高水平。肝窦内皮细胞在正常情况下可检测到少量 P-选择素和 ICAM-1,烧伤血清作用后增多的状况和肝细胞相同;③正常血清对肝细胞和中性粒细胞复合培养,其粘附力渐增加,用烧伤血清后其粘附力于1～2小时较对照组增加显著,随后粘附力下降,与对照组无差异,到24小时反较对照组为低,ICAM-1单抗有降低粘附力的作用。结论严重烧伤后早期粘附分子 P-选择素和 ICAM-1在肝窦内皮细胞和肝细胞表面的增加是中性粒细胞在肝脏中聚集的关键,介导了中性粒细胞对肝脏功能的损害。