人端粒酶反转录酶启动子调控的microRNA-21海绵抑制剂慢病毒载体的构建及功能分析

目的 构建由人端粒酶反转录酶（hTERT）启动子调控的microRNA-21(miR-21)海绵抑制剂慢病毒载体,探讨该重组慢病毒载体对端粒酶阳性肿瘤的特异性抑瘤作用及其机制。 方法 将hTERT启动子核心序列取代慢病毒载体RFP上游的CMV启动子;将重组成功的慢病毒载体Lenti-hTERT-miR-21-sp感染端粒酶阴性细胞HBE及端粒酶阳性肿瘤细胞A549、H1299,观察RFP的表达情况;同时在肿瘤细胞中检测抑制miR-21表达后对细胞生长、凋亡的影响;并应用含人类全长基因的cDNA表达谱芯片,对抑制miR-21表达后人肺癌细胞株A549中差异表达基因进行分析。 结果 经酶切及测序法鉴定慢病毒载体构建成功;将包装后获得的高滴度病毒颗粒感染目的细胞后,发现重组病毒只能在端粒酶阳性肿瘤细胞中特异性高表达,且下调miR-21基因表达后,肿瘤细胞的生长能力受到抑制,凋亡率明显上升（P<0.05）;与对照相比,抑制miR-21表达的A549细胞中差异表达的基因共有64条,其中20条上调,44条下调。 结论 hTERT启动子能够严格地引导病毒载体在端粒酶阳性肿瘤细胞中特异性的封闭miR-21的表达,实现抑制肿瘤细胞生长的作用;芯片结果提示,miR-21引发肺癌可能是多因素多基因共同作用的结果。     

外周血基因组DNA提取方法比较

目的建立快速经济有效提取微量外周血基因组DNA的方法。方法采用酚/氯仿提取法、NaCL沉淀法和试剂盒法,直接从人外周血中提取基因组DNA,并以此为模板,进行肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)基因片段的扩增及鉴定。结果酚/氯仿法和试剂盒法提取的DNA量大,需血量少,用于PCR扩增结果稳定。结论酚/氯仿提取外周血DNA稳定、高效、经济,可用于批量临床标本的制备。     

浸润性肺腺癌患者预后危险因素分析

目的分析影响浸润性肺腺癌患者预后的独立危险因素。方法选取2012年1月至2015年12月经舟山医院手术病理检查结果确诊为浸润性肺腺癌的患者368例,按随访截至时间生存情况分为死亡组（71例）和存活组（297例）。采用Kaplan-Meier法绘制所有患者术后5年生存曲线,并采用字2检验对所有患者的相关临床病理因素进行单因素分析,将单因素分析筛选出与患者术后生存有关的变量,纳入Cox回归比例风险模型进行多因素分析、建立回归方程,判定影响预后的独立危险因素。结果两组患者在Ki-67、肿瘤病理亚型、肿瘤类型、肿瘤大小、有无淋巴结转移方面比较差异均有统计学意义（均P＜0.05）,而在性别、年龄、肿瘤生长部位方面比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。Ki-67指数、肿瘤大小均与患者的5年生存率呈显著相关（均P＜0.05）。无淋巴结转移的患者5年生存率（91.1%）明显优于有淋巴结转移的患者（31.7%）,差异有统计学意义（P＜0.05）。在不同的病理亚型中,以微乳头为主的肺腺癌患者5年生存率明显低于以附壁生长为主的患者（P＜0.05）。而肿瘤类型为周围型患者的5年生存率明显优于中央型患者（P＜0.05）。多因素Cox回归分析表明,Ki-67指数和有无淋巴结转移均是影响浸润性肺腺癌患者预后的独立危险因素（均P＜0.01）,且高Ki-67指数与死亡的风险呈正相关（P＜0.01）。而肿瘤大小、肿瘤类型以及肿瘤病理亚型与浸润性肺腺癌患者预后无明显相关性（均P＞0.05）。结论较高的Ki-67指数与淋巴结转移是影响浸润性肺腺癌患者预后的独立危险因素。     

药物诱导肺癌细胞衰老的体外研究

目的 探讨药物诱导肿瘤细胞衰老的可能机制和对肿瘤治疗的潜在价值。方法 用不同浓度的抗肿瘤药物顺铂(DDP)、Nutlin-3的活性异构体(Nutlin-3a)、4-异硫脲基丁腈盐酸盐(Kevetrin)分别处理人肺癌A549、H460、H2228细胞,采用β-半乳糖苷酶染色检测衰老细胞阳性率,EdU染色检测增殖细胞阳性率,CCK-8法检测细胞存活率,Real-time qPCR法检测肺癌细胞衰老相关分子p21 mRNA表达水平,Western blot法检测药物处理肺癌细胞衰老相关分子p53和p21蛋白表达情况。结果 DDP、Nutlin-3a和Kevetrin可诱导A549、H460和H2228细胞胞体增大、蓝染衰老细胞增多,阳性细胞率与各自对照组比较差异均有统计学意义(均P<0.05)。DDP和Nutlin-3a处理的A549细胞,荧光显微镜检测发现EdU红色荧光增殖细胞阳性率与对照组相比明显减少(均P<0.05);此外,药物的细胞毒性实验也发现,DDP、Nutlin-3a和Kevetrin均可使肺癌细胞存活率明显降低(均P<0.05)。与各自对照组相比,6.25...     

甲型流感患者外周血白细胞介素10、干扰素-γ及免疫调节分子T细胞免疫球蛋白及黏蛋白域蛋白3分子表达检测

目的 探讨细胞因子白细胞介素10(interleukin-10,IL-10)、干扰素-γ(interferon-gamma,IFN-γ)及免疫调节分子T细胞免疫球蛋白及黏蛋白域蛋白3(T cell immunoglobulin-and mucin-domain-containing molecule-3,Tim-3)在...     

急性脑梗死患者单核细胞CD14+CD16+亚型的表达变化及临床意义

目的探讨急性脑梗死患者单核细胞CD14+CD16+亚型的表达及其临床意义。方法选择发病＜24h入院的36例急性脑梗死患者为脑梗死组、同期在神经内科治疗的32例头晕患者为对照组，检测脑梗死组患者入院当天及第2、5、7~10天以及随访第90天，对照组入院当天的血清单核细胞计数、单核细胞各亚型百分比，分析单核细胞亚型与病情的关系。结果与对照组相比，脑梗死组经典型单核细胞百分比各时间点均无明显变化（均P＞0.05）；中间型单核细胞百分比入院当天及第2、5、7~10天均明显升高（均P＜0.05）；非经典型单核细胞百分比入院第2、5天均明显下降（均P＜0.05）。脑梗死组入院当天单核细胞计数与NIHSS评分呈正相关（r=0.508，P＜0.05）；3个亚型百分比与NIHSS评分均未见相关（均P＞0.05）。与未感染者比较，脑梗死感染患者入院第2、5、7~10天单核细胞计数均明显升高（均P＜0.05），非经典型单核细胞百分比均明显下降（均P＜0.05）；中间型单核细胞百分比入院当天及第2、5天均明显升高（均P＜0.05）；经典型单核细胞百分比各时间点比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。与预后良好组比较，脑梗死预后不良组入院第2、5天单核细胞计数、中间型单核细胞百分比均明显升高（均P＜0.05），非经典型单核细胞百分比均明显下降（均P＜0.05）；经典型单核细胞百分比各时间点比较差异均无统计学意义（均P＜0.05）。结论急性脑梗死患者单核细胞CD14+CD16+亚型变化有一定的规律，中间型单核细胞、非经典型单核细胞可能与脑梗死相关感染及预后有关。     

mTOR信号通路相关分子在肺鳞癌组织中表达的意义

目的探讨哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路相关分子在肺鳞癌组织中的表达情况及其与临床病理特征、生存期的关系，寻找治疗的新靶点。方法收集2010年6月至2017年12月在舟山医院经手术病理证实的肺鳞癌组织标本93例，采用免疫组织化学方法检测mTOR信号通路相关分子的表达情况，分析各分子与临床病理特征及生存期关系。结果10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物（PTEN）低表达患者中，肿瘤直径＞3cm患者所占比例为89.1%（49/55），与高表达患者比较差异有统计学意义（P＜0.05）。真核细胞翻译起始因子4E结合蛋白1（4EBP1）高表达患者中，淋巴结发生转移与高于Ⅱ期患者所占比例分别为47.5%（29/61）与80.3%（49/61），与低表达患者比较差异均有统计学意义（均P＜0.05）。p-mTOR高表达患者中，患者整体生存期较短（35.0个月），与低表达患者比较差异有统计学意义（P＜0.05）。结论mTOR信号通路相关分子有可能成为肺鳞癌诊断指标或作为临床治疗的靶点。