人羊膜负载猪角朊细胞构建皮肤表皮替代物的实验研究

背景人羊膜为半透明的薄膜,含有多种促进细胞增殖的营养成分,是一种较好的负载角朊细胞的生物材料.目的将人羊膜负载培养猪角朊细胞构建皮肤表皮替代物,并观察猪角朊细胞在人羊膜上生长增殖的形态特点.设计以细胞为研究对象,单一样本研究,重复测量观察.单位解放军第三军医大学预防医学院全军复合伤研究所.材料实验于2001-01/11在创伤、烧伤和复合伤国家重点实验室,第三军医大学预防医学院全军复合伤研究所完成.猪角朊细胞取自3月龄贵州小香猪.方法将贵州小香猪的角朊细胞原代培养,传代扩增后,将角朊细胞以1.63×105/cm2的密度接种于人羊膜基质面,逐日于倒置显微镜下观察角朊细胞的生长增殖变化情况,并于培养3 d与15 d进行光镜、电镜观察,检测角朊细胞在人羊膜上的生长情况.主要观察指标角朊细胞在人羊膜上的生长情况.结果倒置显微镜下观察接种后30 min内明显见到角朊细胞在人羊膜上黏附,24 h内大部分黏附生长,3 d形成单层完全覆盖人羊膜.光镜下人羊膜负载角朊细胞3 d,可见角朊细胞在人羊膜基质面黏附呈单层生长,细胞扁平紧密排列.扫描电镜下可见胞体呈多边形,多见胞膜突起.透射电镜下可见角朊细胞与人羊膜黏附良好,生长在人羊膜上的角朊细胞内有许多角质丝.生长至15 d,在倒置显微镜和扫描电镜下均可见,细胞因过于拥挤而隆起,因老化而形成较多碎片,部分细胞有空洞形成.结论人羊膜是角朊细胞在体外培养的良好载体,对角朊细胞有明显的促增殖作用.但人羊膜负载角朊细胞生长至15 d,因老化部分细胞有空洞形成.     

通过基因芯片筛选创伤修复差异表达基因

目的通过基因芯片筛选同真皮间充质干细胞相关的创伤修复差异表达基因。方法利用贴壁生长的特性分离大鼠真皮间充质干细胞，用Hpure提取伤口液刺激前后dMSCs和创伤前后大鼠皮肤组织中总RNA。PCR扩增已构建抑制消减杂交差异表达文库中485个克隆的插入片断，送北京博奥制作基因芯片。提取的RNA反转录后分别同芯片杂交，找出在细胞水平和组织水平同时高表达的克隆。将这些克隆测序，进行生物信息学分析。结果分离的大鼠真皮间充质干细胞呈纺锤形，在体外显示多向分化潜能。抽提伤口液刺激前后dMSCs和创伤前后大鼠皮肤组织中总RNA，反转录后和基因芯片杂交，发现可能同创伤愈合相关的13条基因，其中热休克蛋白70（HSP70），基质金属蛋白酶3（MMP3），白细胞蛋白酶抑制因子（SLPI）等可能在创伤愈合中有重要意义。结论抑制消减杂交和基因芯片结合是筛选差异表达基因的一种有效方法。伤口液刺激前后dMSCs中差异表达基因的发现能为从基因水平探讨dMSCs参与创伤愈合的分子机制提供新的研究靶点。     

SDF-1 cDNA转染人骨髓间充质干细胞的实验研究

本研究旨在探讨基质细胞衍生因子-1（SDF-1）cDNA瞬时转染人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）前后hBMSCs中SDF-1mRNA表达的情况。在分离、培养、鉴定人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）和构建SDF-1-pIRES2-EGFP真核表达载体的基础上,通过脂质体介导法将SDF-1真核表达质粒转染至hBMSCs,观测绿色荧光蛋白的表达并用RT-PCR方法检测瞬时转染效率。结果发现：SDF-1-pIRES2-EGFP瞬时转染后hBMSCs的SDF-1mRNA表达增高约20%左右。结论：阳离子脂质体可以将SDF-1cDNA真核表达质粒瞬时转染入hBMSCs,但转染效率低下,不能获得足够数量的稳定转染细胞供后续实验,因此需对转染方法作进一步的探讨。     

诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞和成软骨细胞分化

目的：探讨小香猪骨髓间充质干细胞（MSC）向成骨细胞和成软骨细胞诱导分化的能力。方法：选用早期贴壁培养的小香猪骨髓MSC，在传代两三次后加入条件培养基，观察了细胞的形态学变化，同时检测碱性磷酸酶、钙盐沉积以及细胞外基质和Ⅱ型胶原的表达。结果：MSC在骨形成蛋白（BMP）、地塞米松和β－磷酸甘钠的作用下，两三天细胞从梭形变为圆形或类圆形，细胞体积增大，12－15d时细胞集落的表面可见有颗粒状物质分泌，碱性磷酸酶染色为阳性，20－25d时，分泌颗粒更加明显，核固红染色为阳性，表现出成骨细胞的特点，在培养体系中加入地塞米松和转化生长因子－β1后两三，可见细胞由类成纤维状变为圆形成椭圆形状，有的呈肾性，体积增大，10d后可见细胞周围有基质分泌，Ⅱ型胶原染色为阳性，表现为软骨细胞分化的特点。结论：在一定培养条件下成功诱导小香猪骨髓MSC向成骨细胞和成软骨细胞分化，为我们进一步的研究打下基础。     

羊膜促进间充质干细胞表皮细胞生长的形态学特征

目的将人羊膜(humanamnioticmembrane,HAM)负载培养猪骨髓间充质干细胞(MSCs)重建皮肤真皮替代物,负载培养猪表皮细胞重建皮肤表皮替代物,并观察猪MSCs、表皮细胞在HAM上生长增殖的形态特点。方法将贵州小香猪的MSCs、表皮细胞原代培养,传代扩增后,分别以不同的密度接种于HAM的基质面,逐日于倒置显微镜下观察MSCs、表皮细胞的生长增殖变化情况,并于培养3～18d进行光镜、电镜观察,检测MSCs、表皮细胞在HAM上生长的形态特点。结果接种后30min内就明显见到MSCs、表皮细胞在HAM上贴附,24h内大部分贴附生长,3d形成单层完全覆盖HAM,超微结构形态良好。结论HAM是MSCs、表皮细胞在体外培养的良好载体,对MSCs、表皮细胞有明显的促增殖作用。     

烧伤小鼠肝组织糖皮质激素受体的变化

目的 观察烧伤小鼠24h内肝糖皮质激素受体在蛋白及mRNA水平的时相变化特点。方法 将60只BALB／C小鼠随机分为正常对照组和实验组，实验组给予背部Ⅲ度15％－20％烧伤。分别于伤后2、4、6、12、24h测定血清皮质酮浓度，用Westernblotting、RF－PCR蛋白质和mRNA水平测定肝组织糖皮质激素受体。结果 烧伤小鼠血清皮质酮浓度2－4h达到高峰，24h仍未恢复正常；肝组织糖皮质激素受体在蛋白质水平4－6h降至最低；而mRNA水平仅仅在伤后2h有短暂降低。结论 烧伤应激引起小鼠血清皮质酮水平明显升高，其受体在蛋白质及mRNA水平均可降低，但蛋白的降低不仅仅发生在mRNA水平。     

放烧复合伤及其神经内分泌治疗

放射复合伤多发生于核事故、核战争及核恐怖袭击中,受到国内外的高度重视^[1-2]。放烧复合伤(即放射损伤合并烧伤)是其中最为常见的一种,在发病早期即表现出复杂的病理改变,最主要的特征是造血功能障碍、免疫调节紊乱、胃肠道功能受损、烧伤创面的延迟愈合和急性炎性反应^[3]。在整个放烧复合伤(尤其是重度及以上放烧复合伤)病程中,各个病理发生环节之间的交互影响使得病情逐渐加重和恶化,同时也使放烧复合伤的治疗变得极为棘手,迫切需要寻找新的有效的治疗方法。因此,通过调节神经内分泌系统来达到治疗目的的方法就应运而生。本文就此方面的研究进展作一简述。     

促排剂的研究进展及在放射性突发事件中的应用

一般说来，在和平年代，放射突发事件有4种可能的方式：①放射性散布装置（radioactive dispersal device，RDD），又叫脏弹（dirty bomb），是将放射性物质与普通炸弹捆绑在一起，当炸药被引爆时，放射性物质就随着向周围地区喷发。②核设施遭袭击导致源项释放；③盗窃核武器或粗糙核装置；④小当量核爆炸，其中，受脏弹袭击的可能性最大。     

小鼠烧伤早期巨噬细胞糖皮质激素受体及细胞因子蛋白表达的变化

目的　探讨小鼠烧伤后早期巨噬细胞糖皮质激素受体 (GR)、核转录因子 (NF kB)、肿瘤坏死因子 α(TNF α)和白介素 1β(IL 1β)蛋白表达的变化。 方法　将培养的巨噬细胞株ANA 1注入小鼠腹腔内 ,小鼠行 15 %TBSAⅢ度烧伤 ,收集腹腔巨噬细胞 ,应用免疫组化和Westernblot方法 ,观察烧伤后 2、6小时巨噬细胞GR、NF kB、TNF α和IL 1β蛋白表达的变化。 结果　烧伤后巨噬细胞免疫组化染色GR、NF kB阳性表达减弱 ,TNF α和IL 1β阳性反应增强。Westernblot分析表明烧伤后GR、NF kB蛋白含量降低。 结论　烧伤后巨噬细胞GR、NF kB蛋白减少 ,TNF α和IL 1β增加 ,说明巨噬细胞激活在烧伤后炎症反应中发挥重要作用