病理性近视线粒体DNA替代环区多态性研究

目的 对病理性近视线粒体DNA替代环（D-Loop）区进行测序,分析D-Loop区变异位点或多态性与病理性近视的关系.方法 实验研究.对127名病理性近视患者和104名正常对照者提取基因组DNA进行PCR扩增、双向测序,与修正的剑桥参照序列进行比对,分析变异位点.临床数据处理分析使用独立样本t检验,变异位点频率差异使用x^2检验和Bonferroni校正检验.结果 在127名病理性近视患者线粒体DNA D-Loop区中发现变异位点168个,3个为新的变异位点,其中有53个变异位点只在病理性近视中出现,经与正常对照组比较,差异无统计学意义.总的变异位点数目为1270个,平均每名病理性近视患者为10个;T152C在病理性近视中占19.7％（25/127）,在正常对照中占31.7％ （33/104）,两组差异存在统计学意义（x^2=4.412,P=0.036）,但经过Bonferroni校正后差异无统计学意义.结论 病理性近视线粒体D-Loop区为高度变异区域,为一个变异热点区域,线粒体D-Loop区变异位点是否与病理性近视有关还需进一步研究证实.     

11个携带线粒体tRNASer（UCN）G7444A突变的中国汉族非综合征型耳聋家系分析评估

目的：通过对11个携带线粒体tRNASer（UCN）G7444A突变的中国汉族非综合征型耳聋家系进行临床和分子遗传学特征等分析评估,探讨线粒体tRNASer（UCN）G7444A突变在母系遗传非综合征型耳聋发生发展中的作用。方法：PCR扩增2650例中国汉族非综合征型耳聋样本的线粒体12SrRNA、线粒体tRNASer（UCN）基因以及GJB2基因。对11个携带线粒体tRNASer（UCN）G7444A突变的中国汉族非综合征型耳聋家系进行听力学检测、耳聋相关热点基因突变检测以及家系资料等综合分析。结果：在2650例中国汉族非综合征型耳聋患者中,14例携带线粒体tRNASer（UCN）G7444A突变,突变率为0.53%。在这11个携带线粒体tRNASer（UCN）G7444A突变的家系中,同时携带线粒体tRNASer（UCN）G7444A突变和线粒体12SrRNAA1555G、12SrRNAC1494T或GJB2c.235delC的家系分别为3、1和2个。临床资料分析表明,这11个中国汉族非综合征型耳聋家系母系成员在听力损失严重程度、发病年龄以及耳聋外显率方面存在较大差异。同时携带线粒体tRNASer（UCN）G7444A突变和线粒体12SrRNAA1555G、C1494T或GJB2c.235delC突变家系的耳聋平均外显率分别为29.4%、42.9%和19.0%。前两者的外显率明显高于只携带线粒体tRNASer（UCN）G7444A突变家系的耳聋平均外显率（为14.0%）。结论：线粒体tRNASer（UCN）G7444A突变可能与线粒体12SrRNAA1555G和C1494T原发突变存在协同作用,共同影响非综合征型耳聋的表型。     

17例携带m.3460G>A突变的Leber遗传性视神经病变的线粒体单体型分析

目的：研究线粒体单体型对17个携带m.3460G＞A突变Leber遗传性视神经病变（LHON）家系外显率的影响。方法：对收集的1 218个LHON患者进行m.3460G＞A筛查,然后对携带m.3460G＞A患者进行线粒体全基因组测序、单体型分析。结果：共筛查出17个携带m.3460G＞A突变家系,占该研究群体的1.4%（17/1 218）,线粒体单体型分析显示,其分别为单体亚型A、B5b、B5b2、C4a1、D4、D5b1、F1、F1a1、H2、M7b1、M7b2、M7c1、M8a2、M10a、M12,单体亚型D5b1有3例,其余各1例。11例单体亚型属于单体型M,6例属于单体型N,前者出现视力损伤的人数明显多于后者,损伤程度亦重于后者。结论：LHON家系中单体型M出现重度视力损伤的概率大于单体型N。     

对3个携带tRNALeu(CUN) 12308A>G突变的Leber遗传性视神经病变家系的检测分析

目的：探讨tRNALeu(CUN) 12308A＞G突变是否影响Leber遗传性视神经病变（LHON）的表型表达。方法：对295例无血缘关系的汉族LHON患者和316例正常对照者进行线粒体突变基因筛查,并对筛出的3个携带m.12308A＞G突变并具有典型LHON临床表现的家系进行线粒体全序分析、单体型分析以及拷贝数的测定。结果：3个家系均不携带主要原发突变位点,但在tRNALeu(CUN)上高度保守的44位发生了m.12308A＞G同质性突变,且3个先证者的单倍体型均属于东亚单倍体型H2,但发病年龄和视力损伤程度有所不同,并在正常对照者中未检出m.12308A＞G突变。在拷贝数测定中发现突变细胞的线粒体拷贝数明显减少。结论：m.12308A＞G突变可能是与LHON相关的突变位点,但突变本身并不足以造成LHON的表型表现,其他修饰因子（核基因修饰、线粒体单体型及环境因素）在LHON的发病进程中发挥了一定的作用。     

线粒体DNA突变与头颈部鳞状细胞癌

线粒体DNA参与编码氧化磷酸化复合体系中的13种多肽链亚单位,线粒体DNA突变可以引起细胞氧化呼吸功能紊乱.肿瘤细胞能量代谢异常是其特点之一,因此线粒体DNA突变与肿瘤的发生可能存在某种联系.本文就线粒体DNA突变在头颈部鳞状细胞癌中的研究进展进行综述.     

线粒体电压依赖阴离子通道对携带线粒体DNAA4263G突变的细胞株线粒体钙循环的影响

目的 研究线粒体外膜电压依赖阴离子通道(voltage-dependent anion channel,VDAC)在携带线粒体DNA (mitochondrial DNA, mtDNA) A4263G突变的细胞株线粒体钙循环中的作用. 方法 对该家系的4个母系成员(3个血压异常和1个血压正常者)和3名遗传背景相同的对照者建立了传代淋巴细胞系,利用共聚焦显微镜评价VDAC在携带mtDNA A4263G突变的高血压患者细胞线粒体钙循环中的作用. 结果 与正常对照者淋巴细胞比较,突变细胞株线粒体内钙荧光强度及线粒体膜电势(Δψm)降低,加入苍术苷(线粒体通道蛋白开放剂)后正常者线粒体内钙荧光强度增加,而突变携带者没有明显改变,但两者Δψm均降低,加入环孢素A(CsA)后可以抑制苍术苷作用. 结论 线粒体VDAC功能异常导致mtDNA A4263G突变携带者细胞线粒体对钙通透性增加,Δψm降低,加入苍术苷进一步导致Δψm降低,加入CsA后可以抑制苍术苷作用.     

多重等位基因PCR检测线粒体12S rRNA基因突变

目的 探讨多重等位基因PCR法同时检测氨基糖甙类药物性耳聋相关的线粒体12S rRNA基因A1555G和C1494T突变的临床应用价值.方法 以3种基因型(野生型、A1555G突变型和C1494T突变型)的质粒标准品为模板,分别设计针对线粒体1555和1494位点野生型和突变型的特异性引物.用多重等位基因PCR技术同时检测A1555G和C1494T突变,并初步用于138例非综合征型耳聋患者的临床基因突变检测分析,最后通过DNA测序法评估其准确性.结果 采用多重等位基因特异性PCR同时检测138例非综合征型耳聋患者中A1555G和C1494T突变的检出率为7.97%(11/138),其中,A1555G突变型10例,C1494T突变型1例;DNA测序分析检测突变型检出率为7.97%(11/138).2种方法具有极好的一致性(Kappa=1.000,P＜0.01).结论 多重等位基因PCR是一种简便、准确、有效的A1555G和C1494T突变检测方法,可用于鉴定氨基糖甙类药物性耳聋相关的线粒体12S rRNA基因突变,从而有效预防氨基糖甙类药物性耳聋的发生.

Abstract：

Objective To investigate the clinical application of multiplex allele-specific PCR assays for simultaneous detection of the mitochondrial 12S rRNA A1555G and C1494T mutations associated with aminoglycoside-induced hearing impairment.Methods Three standard plasmids of different genotypes (wild-type, A1555G mutant and C1494T mutant) were constructed for templates and allele-specific primers aiming directly at wild-type and mutant of mitochondrial DNA nt1555 and nt1494 were designed for developing a multiplex allele-specific PCR technique to detect the A1555G and C1494T mutations.Then the method was applied to clinical screening of 138 non-syndromic hearing loss subjects and confirmed by DNA sequencing.Results Multiplex allele-specific PCR was successfully applied to the detection of A1555G and C1494T mutations in a cohort of 138 Han Chinese genetically unrelated hearing-loss subjects.Finally, 11(7.97%) unrelated affected subjects harbored the A1555G and C1494T mutations in the 12S rRNA gene(10 cases for A1555G and 1 cases for C1494T), which was well consistent with results of DNA sequencing [7.97%(11/138), Kappa=1.000, P＜0.01].Conclusion This study indicates that the multiplex allele-specific PCR assay is useful, convenient and reliable in the detection of the A1555G and C1494T mutations, which could identify the subjects at risk and effectively prevent of aminoglycoside-induced hearing loss.     

Leber遗传性视神经病变分子遗传学研究进展

Leber遗传性视神经病变(Leber hereditary optic neuropathy, LHON) 是一种导致双眼快速的、无痛性的中心视力丧失的母系遗传性疾病。主要是由线粒体DNA（mitochondrial DNA,mtDNA）发生点突变所致。本文主要介绍LHON原发性、继发性和其它相关位点突变,阐述核修饰基因、mtDNA单倍型及环境因素（吸烟、饮酒等）对LHON外显率和发病严重程度的影响。     

口腔拭子在药物性耳聋基因检测中的应用

目的：探讨口腔黏膜上皮细胞基因组DNA在药物性耳聋基因A1555G及C1494T突变检测中的应用,寻求基因检测中更简单快捷并无损的样本来源。方法：采集97例来自温州特殊教育学校非综合征型耳聋学生的口腔拭子和外周血,分别提取基因组DNA,进行浓度与纯度的测定、基因扩增及产物测序,比较2种样本来源及2种方法提取的基因组DNA的浓度、纯度、扩增成功率,并将测序结果与人类线粒体DNA剑桥参考序列进行比对。结果：口腔拭子DNA的手工法提取浓度（42.5±41.7）ng/mL与试剂盒法DNA浓度（44.8±43.4）ng/mL差异无统计学意义（P〉0.05）;手工法DNA纯度（1.45±0.73）低于试剂盒法（1.87±0.87）,两组间差异有统计学意义（P〈0.05）;二者扩增成功率与外周血差异均无统计学意义（P〉0.05）;口腔拭子DNA的药物性耳聋基因扩增产物长短一致,测序结果完全相符,均显示A1555G突变阳性2例,阴性95例;C1494T突变97例均阴性。结论：无损性样本口腔拭子扩增成功率高,诊断结果可靠,可替代外周血作为药物性耳聋基因检测的DNA来源,具有一定的临床应用价值。     

耳聋相关的线粒体DNA继发突变

耳聋是人类最常见的疾病之一,每700～1000名新生儿中就有一例听力障碍患儿[1].我国目前有听力言语残疾者2780万人[2].耳聋是由遗传和环境等因素共同决定的,其中前者的作用约占50％.遗传因素引起的耳聋包括综合征型耳聋(30％)和非综合征型耳聋(70％)[3].非综合征型耳聋可以根据不同的遗传方式进一步分为常染色体隐性遗传、常染色体显性遗传、X-连锁遗传和母系遗传(女性后代可以发病而男性后代不发病)等类型[4].线粒体耳聋(即与线粒体功能障碍有关的耳聋)约占全部耳聋患者的5％[5],按此比例目前我国约有100多万线粒体耳聋患者[6].