人Ⅱ型穿膜蛋白CD74基因片段的克隆及原核表达

[目的]扩增、克隆人Ⅱ型穿膜蛋白CD74基因片段,并在大肠杆菌中表达出具有生物活性的重组CD74蛋白.[方法]根据人CD74基因序列,设计、合成PCR引物,利用RT-PCR技术,从人Raji B细胞中扩增CD74基因片段.将CD74基因定向插入原核表达载体pGEX-4T-1,构建重组表达载体pGEX-4T-CD74,并转化工程菌BL21(DE3).用IPTG诱导BL21(DE3)中导入的CD74基因的表达,并行SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物.用GSTrap亲合柱纯化重组CD74蛋白,通过体外血管生成实验鉴定重组CD74蛋白对巨噬细胞移动抑制因子(MIF)的阻断作用.[结果]扩增出人CD74基因片段,并成功构建了重组质粒pGEX-4T-CD74.测序结果显示,克隆的CD74 cDNA长480 bp,序列与文献报道一致.经IPTG诱导,特异表达出可溶性的44 KDa的重组蛋白,其可被人CD74抗体识别.体外血管生成实验结果显示,重组CD74蛋白能特异地阻断MIF的促血管生成作用.[结论]克隆了人CD74基因片段,并在大肠杆菌中表达出具有生物活性的重组CD74蛋白.     

血管生成素1基因真核表达质粒的构建及测序

目的:构建血管生成素1(Ang1)的真核表达质粒psecTagBk-Ang1。方法:用PCR方法从人心脏文库中扩增Ang1基因全外显子片段, 并定向插入真核表达载体psecTagBk中, 用限制性内切酶酶切和测序鉴定克隆的Ang1基因。结果:扩增出人Ang1cDNA片段, 测序结果显示扩增的Ang1cDNA包括长为1497bp、1494bp的2种剪切体, 分别编码498和497个氨基酸残基。限制性内切酶酶切和DNA测序证实获得正确的重组质粒psecTagBk-Ang1。结论:发现2种共存的Ang1cDNA剪切体, 并成功构建真核表达质粒psecTagBk-Ang1。     

巨噬细胞移动抑制因子-173G/C多态性与冠心病的相关性研究

目的研究巨噬细胞移动抑制因子（macrophage migration inhibitory factor, MIF）基因MIF 5′非翻译区-173G／C多态性在中国南方汉族人群中的分布及与冠心病的相关性。方法采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性技术，对汉族138例冠心病患者及163名正常人群MIF基因-173G／C位点进行研究，对于限制酶酶切结果再进行DNA测序鉴定。结果冠心病患者与正常对照中只检出-173GG和-173GC基因型，均未检出-173CC基因型。正常人群和冠心病患者的MIF-173G等位基因频率分别为0．966和0．917，MIF-173C等位基因频率分别为0．034和0．083，冠心病患者MIF-173GC基因型频率（0．167）明显高于对照组（0．068）（OR：2．764，95％CI：1．295～5．899；P=0．007）。结论MIF基因-173G／C位点多态性与冠心病有关，C等位基因可能是汉族人群冠心病的易感性标志。     

人微小RNA-133a(miR-133a)重组腺病毒的构建和鉴定

目的: 构建人miR-133a重组腺病毒,研究其在人骨髓间充质干细胞(hMSCs)中的表达。方法: 从人基因组DNA中扩增包含miR-133a的PCR产物，并定向插入腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV。将经pmeⅠ线性化的重组穿梭载体与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化感受态大肠杆菌BJ5183，通过同源重组获得重组腺病毒质粒rAd-mir-133a。将rAd-mir-133a在人胚肾293细胞（HEK293）中包装并扩增出miR-133a的重组腺病毒。将重组腺病毒感染hMSCs，利用RT-PCR和实时定量PCR分别检测初级miR-133a和成熟miR-133a的表达。结果: 限制性内切酶分析和DNA测序结果显示，重组腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV-miR-133a构建正确。在HEK293细胞中成功包装并扩增出重组腺病毒rAd-miR-133a。rAd-miR-133a感染的hMSCs中初级miR-133a转录子和成熟miR-133a表达显著增强。结论: 成功构建了人miR-133a 重组腺病毒，并在hMSCs中高效表达出miR-133a，为进行miR-133a的功能研究创造条件。     

幽门螺杆菌阳性胃炎患者胃粘膜-氧化氮合酶活力变化的意义

目的探讨幽门螺杆菌(Hp)感染时胃粘膜内一氧化氮合酶(NOS)活性和一氧化氮(NO)含量与细胞凋亡改变的意义.方法选择慢性活动性胃炎病人27例,其中Hp阳性者15例,Hp阴性者12例正常对照组10例.应用生物化学方法和切口末端标记法(Tunel)检测胃粘膜组织中一氧化氮产物N0-2水平、NOS活性及细胞凋亡指数.结果Hp感染时,胃粘膜NOS活性、NO-2水平及细胞凋亡指数明显升高,较Hp阴性组差异显著(P＜0.01),胃炎积分数与胃粘膜组织中NOS活性和NO-2水平呈明显正相关(r=0.66和0.84,P＜0.01).当根除Hp后,胃粘膜组织NOS活性,NO-2水平及细胞凋亡指数则显著降低,细胞凋亡指数与NOS活性和N0-2水平呈明显正相关(r=0.68和0.79,P＜0.01).结论Hp感染时可引起胃粘膜组织NOS活化,NO过量产生,细胞凋亡增加,这从又一方面说明Hp感染在胃腺癌发病机制中作用.     

环状RNA _005647通过结合miR-99b-5p抑制心肌细胞中肥厚相关基因的表达

目的研究环状RNA circRNA_005647抑制心肌肥厚相关基因表达的作用机制。方法建立血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)灌注诱导的心肌肥厚小鼠模型。原代分离获得C57BL/6乳小鼠心肌细胞(NMVC),AngⅡ处理NMVC建立心肌细胞肥大模型。利用NMVC,分别感染circRNA_005647重组腺病毒(rAd-circRNA_005647)和转染miR-99b-5p模拟物来研究对NMVC肥大的影响。通过双荧光素酶报告基因实验和RNA Pull-down实验验证circRNA_005647与miR-99b-5p的结合作用。实时荧光定量PCR和Western blot检测NMVC中心肌肥厚相关基因的mRNA和蛋白表达水平。结果在AngⅡ诱导的小鼠心肌肥厚模型和心肌细胞肥大模型中,circRNA_005647及其宿主基因肌球蛋白IXA(Myo9a)表达升高。过表达circRNA_005647可抑制AngⅡ诱导的NMVC中肥厚相关基因心房钠尿肽(Anp)和肌球蛋白重链7(Myh7)基因表达升高。circRNA_005647与miR-99b-5p间存在结合作用。过表达circRNA_005647可抑制miR-99b-5p促心肌细胞肥大的作用。结论circRNA_005647通过结合miR-99b-5p发挥抑制心肌细胞肥大的作用。     

Upregulation of miR-29b contributes to the anti-fibrotic effect of macrophage migration inhibitory factor in diabetic myocardial fibrosis

Background Macrophage migration inhibitory factor(MIF) possesses proinflammatory function when secreted from the cells, and it also exhibits antioxidant properties based on its intrinsic oxidoreductase activity.However, the role of MIF in cardiac fibrosis is not well known. In the present study, the effect of MIF on fibrosis-associated gene expression and the underlying mechanism were examined. Methods The collagen content in mouse myocardium was detected by Masson staining. Expressions of MIF and fibrosis-associated Col1a1, Col3a1 and α-SMA in mouse myocardium or mouse cardiac fibroblasts were detected by quantitative real-time PCR and Western blot assay, respectively. Mature miR-29b expressions in mouse myocardium and cardiac fibroblasts were determined by real-time PCR. Smad3 activation in MIF-treated cardiac fibroblasts was also detected by Western blot assay. Results Compared with the db / m control mice, the collagen content was significantly increased in the myocardium of diabetic db / db mice. MIF was up-regulated, but miR-29b was down-regulated in the diabetic myocardium. Quantitative real-time PCR and Western blot assay showed that MIF could inhibit fibrosis-associated Col1a1, Col3a1 and α-SMA expressions in mouse cardiac fibroblasts.Smad3 activation was inhibited, but miR-29b was up-regulated in MIF-treated cardiac fibroblasts. Enforced expression of miR-29b significantly suppressed Col1a1, Col3a1, and α-SMA mRNA and 1protein expressions in cardiac fibroblasts. Conclusions MIF possesses the anti-fibrosis activity through inhibiting Smad3activation and through up-regulating miR-29b expression, and miR-29b can inhibit fibrosis-associated Col1a1,Col3a1 and α-SMA expressions in cardiac fibroblasts.     

血管紧张素转化酶2基因多态性与高血压合并缺血性脑卒中

目的研究血管紧张素转化酶2（angiotention-converting cnzyme 2，ACE2）基因G9570A多态性与中国南方高血压患者发生缺血性脑卒中的关系。方法采用聚合酶链反应和限制性片段长度多态性的方法，检测单纯原发性高血压136例及原发性高血压合并缺血性脑卒中患者139例的ACE2基因．同时测定颈动脉内膜中层厚度及血浆血管紧张素Ⅱ水平，并进行组间对照研究，探讨ACE2基因G9570A多态性与原发性高血压患者中缺血性脑卒中发病的关系。结果原发性高血压合并缺血性脑卒中组A等位基因频率分布高于原发性高血压组（P〈0．05）；两组ACE2基因型分布不同（P〈0．05）；原发性高血压合并缺血性脑卒中组携带A／AA基因者血浆血管紧张素Ⅱ水平高于携带G／GG基因者（P〈0．05）。在男性原发性高血压合并缺血性脑卒中组携带A基因者颈动脉内膜中层厚度高于携带G基因者（P〈0．05）。结论原发性高血压患者中，携带A／AA基因者发生缺血性脑卒中的危险性相对较大．可能与其血管紧张素Ⅱ水平较高有关。     

舒芬太尼预处理对H9C2细胞缺氧复氧损伤后细胞活力和乳酸脱氢酶活性的影响

目的 观察舒芬太尼预处理对H9C2细胞缺氧复氧损伤后细胞活力和乳酸脱氢酶（LDH）的影响及其浓度依赖性。方法 采用培养的H9C2心肌细胞进行实验,以细胞处于缺氧环境而后进行复氧作为损伤模型。细胞分为正常对照组（NC组）、缺氧复氧损伤对照组（HR组）、舒芬太尼预处理组（SF组）。根据不同浓度舒芬太尼(1×10-11、10-10、10-9、10-8、10-7和10-6mol/L),SF组又分为SF11、SF10、SF9、SF8、SF7、SF6组,每组6孔。处理后MTT法测定细胞活力,检测培养液上清中乳酸脱氢酶（LDH）活力。结果 培养的H9C2细胞经过缺氧3 h复氧3 h之后出现明显的损伤。与NC组相比,HR组培养液上清中LDH活力明显升高、细胞活力显著下降。给予不同浓度的舒芬太尼预处理15 min后再进行缺氧复氧,这种损伤可被抑制。与HR组相比,舒芬太尼预处理组培养液上清中LDH活力降低、细胞活力提高,并发现当舒芬太尼的浓度达到10-9mol/L时其保护效果已基本达到最大,浓度再增大时,保护效果的增加已无显著性差异。结论 舒芬太尼预处理可明显增强H9C2细胞抗缺氧复氧损伤能力,具有浓度依赖性。     

人血管内皮生长因子(VEGF_(165))在大肠杆菌中的表达及鉴定

[目的]克隆人VEGF165基因,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达、纯化重组VEGF165(rVEGF165)蛋白。[方法]用 PCR技术,从人心脏cDNA文库中扩增VEGF165 cDNA,并定向克隆人原核表达载体pET-28a中。用IPTG诱导VEGF165在大肠 杆菌BL21(DE3)中表达。用HisTrap亲合层析柱纯化重组rVEGF165,Western-blot鉴定。根据人VEGF165的促血管内皮细胞增殖 的特性,用MTT法检测重组VEGF165的生物学活性。[结果]从人心脏cDNA文库中扩增出VEGF165 cDNA片段。克隆的 VEGF165 cDNA长576 bp,编码191个氨基酸残基,序列与文献报道一致。SDS-PAGE电泳显示,经IPTG诱导,高效表达出25 ku 的rVEGF165,主要存在于包涵体中,约占菌体总蛋白的20％。MTT检测显示,复性后的rVEGF165能呈剂量依赖性地促进脐静 脉血管内皮细胞增殖。[结论]克隆、测定了人VEGF165基因,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达出rVEGF165。