LPS对大鼠肺微血管内皮细胞SSeCKS的表达影响

目的研究细菌脂多糖（LPS）对大鼠肺微血管内皮细胞（rat pulmonary microvascular endothelial cell，RPMVEC）Src抑制的蛋白激酶C底物（Src-suppressed C kinase substrate，SSeCKS）表达和细胞内定位的影响，探讨SSeCKS参与细胞骨架结构改变的可能机制。方法用植块培养法体外培养大鼠肺微血管内皮细胞，用抗大鼠CD31抗体进行细胞鉴定。LPS刺激体外培养的RPMVEC，用定量PCR、免疫印迹方法检测LPS刺激RPMVEC不同时间SSeCKS mRNA和蛋白的表达情况；用0．05μmol／L蛋白激酶C（PKC）抑制剂（Calphostin C）预处理RPMVEC30min后再用LPS刺激6h，免疫荧光细胞化学法观察Calphostin C对LPS诱导SSeCKS与纤维状肌动蛋白（filamentous—actin，F-actin）细胞内定位和结构改变的影响。结果定量PCR结果显示LPS刺激RPMVEC1h后SSeCKS表达水平达到最高，Westernblot结果与定量PCR结果相一致，同时，LPS以时间依赖的方式诱导SSeCKS磷酸水平增加。免疫荧光结果显示LPS刺激后，F-actin发生重构，细胞内形成应力纤维，SSeCKS向核周、细胞膜纤维、板状伪足末端聚集；Calphostin C部分抑制LPS对内皮细胞F-actin和SSeCKS细胞内定位改变的影响。结论LPS能够诱导内皮细胞SSeCKS表达增加和细胞内定位改变，PKC参与I娲诱导内皮细胞F-ac，6n的重构和SSeCKS重新分布；提示SSeCKS可能与LPS诱导内皮细胞F-actin的重构有关。     

血管性血友病因子基因19内含子MspⅠ多态性与冠心病危险因素的关系

目的 :探讨血管性血友病因子 (vonWillebrandfactor ,vWF)基因 19内含子MspⅠ多态性与冠心病(CHD)危险因素的关系。方法 :应用聚合酶链反应 (PCR)技术结合MspⅠ酶切分析等 ,测定了 10 9例CHD患者和 10 4例健康对照者vWF基因 19内含子MspⅠ限制性片段长度多态性频率 ,同时应用酶联免疫吸附测定(ELISA)技术测定血浆vWF水平。结果 :①vWF基因 19内含子MspⅠ基因型与高血压间差异有统计学意义 ( P<0 .0 5 ) ,而与性别、年龄、糖尿病、高脂血症和吸烟等危险因素差异无统计学意义 (P >0 .0 5 )。②vWF基因 19内含子MspⅠ基因型在高危组和低危组的分布差异无统计学意义 (P >0 .0 5 )。③伴高血压患者中M-/M-基因型与M+/M+基因型和M+/M-基因型的血浆vWF水平之间无统计学意义 (P >0 .0 5 )。结论 :vWF基因 19内含子MspⅠ多态性可能与CHD的危险因素之一高血压有关。     

硫化氢对动脉粥样硬化的影响及其与 CX3CR1 的关系

目的在高脂饮食ApoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化模型中,探讨硫化氢对动脉粥样硬化斑块的影响及其与斑块内趋化因子受体CX3CR1的关系。方法10周龄、雄性纯合子ApoE基因敲除小鼠予以高脂饮食喂养,在高脂饮食喂养第4、8、12、24周时处死小鼠并留取血浆和主动脉,通过化学比色法和Western Blot技术检测血浆硫化氢水平和主动脉胱硫醚-γ-裂解酶（CSE）表达情况。一部分小鼠在高脂饮食4或12周后开始每天予以硫化氢供体药物NaHS（1mg-kg^-1,i．P．）或生理盐水。高脂饮食24周后,通过超声生物显微镜成像技术评估小鼠主动脉及其主要分支内的动脉粥样硬化情况,随后处死小鼠并留取主动脉,通过H＆E染色和免疫组化技术进一步观察小鼠头臂干动脉粥样斑块的病变情况及CX3CR1的表达水平。结果在动脉粥样硬化斑块形成早期,即出现了CSE表达水平的显著降低,随着斑块的进展,CSE的表达水平进一步下调和CSE活性明显下降,最终导致血浆硫化氢水平的显著降低。动脉粥样硬化早期或中晚期予以NariS均可显著延缓动脉粥样硬化斑块的形成和进展,但是NaHS早期干预,其抗动脉粥样化的益处显著优于中晚期干预。NariS的抗动脉粥样硬化益处可能与其抑制斑块内CX3CR1的表达有关。结论动脉粥样硬化过程中存在着内源性硫化氢代谢紊乱,予以NaHS干预可抑制斑块内CX3CR1的表达和延缓动脉粥样硬化的进展,早期NaHS干预的疗效显著优于中晚期干预。     

苗药黑骨藤中绿原酸在大鼠体内药动学研究

目的 采用UPLC-MS/MS法建立大鼠血浆中绿原酸含量测定的方法,并将其应用于黑骨藤中绿原酸在大鼠体内的药动学研究.方法 采用沉淀蛋白法处理血浆样品,以葛根素为内标,色谱柱:ACQUITY UPLC CSH C18(150 mm×3.0 mm,1.7μm),流动相:乙腈-水(0.2％甲酸)(80:20)等度洗脱,流速...     

突触后密度蛋白-95在大鼠坐骨神经损伤后的表达

为了探讨突触后密度蛋白-95(PSD-95)在周围神经损伤过程中的表达变化,本实验建立大鼠坐骨神经夹伤模型,采用荧光定量PCR(real-timePCR)和Western blotting对PSD-95 mRNA及其蛋白水平进行定量检测,应用免疫荧光双标技术观察PSD-95与神经型一氧化氮合酶(nNOS)的共定位情况。结果显示,PSD-95 mRNA及其蛋白在正常坐骨神经中度表达,损伤后迅速下降;PSD-95 mRNA从损伤后2d开始表达上调;而其蛋白水平于损伤后1周明显升高。免疫荧光双标染色证实在坐骨神经损伤后1周PSD-95与nNOS共定位于Schwann细胞上,而与神经丝蛋白NF-200共定位不明显。本研究结果提示PSD-95通过nNOS参与了周围神经损伤修复过程。     

内毒素致伤小鼠肺组织SSeCKS表达变化的研究

目的 观察内毒素，脂多糖（LPS）致伤小鼠肺组织中Src抑制的蛋白激酶C的底物（SSeCKS）的表达变化和细胞定位。方法 腹腔注射LPS制备小鼠内毒素肺损伤模型，依据注射时相和剂量不同随机分组。用Real-time PCR法和Western blot法检测各组肺组织SSeCKS的mRNA和蛋白质水平表达情况，间接免疫荧光双标法检测SSeCKS在肺组织中的细胞定位。结果 SSeCKS表达水平与LPS用量呈现剂量和时间依赖关系：1、5、10和15mg/kg组SSeCKS mRNA水平皆显著高于对照组（P〈0．05），且随注射剂量增高SSeCK SmRNA表达量亦逐渐增高；不同时相LPS（5mg/kg）注射后肺组织中SSeCKS mRNA水平表达呈动态变化过程，1h开始增高，3h达到表达高峰，12h降至正常水平；SSeCKS蛋白水平表达变化与mRNA水平变化相一致。SSeCKS在肺组织中定位于肺泡间隔毛细血管内皮细胞。结论 SSeCKS是炎症反应蛋白，其表达量与炎症的严重程度相关。内毒素可诱导肺泡间隔毛细血管内皮细胞SSeCKS表达上调。     

SHG-44胶质瘤细胞表达β-1,4-半乳糖基转移酶V后对鬼臼乙叉甙敏感性影响

目的:研究鬼臼乙叉甙(Etoposide,VP16)对表达β-1,4-半乳糖基转移酶V(beta-1,4-galactosyltransferaseV,β-1,4-GalTV)的SHG-44胶质瘤细胞死亡和凋亡的影响,为进一步探讨β-1,4-GalTV与化疗药物敏感性的关系奠定基础。方法:通过流式细胞仪(FCM)和Hoechst33258染色法,分析不同浓度的VP16处理转染了正义(GalTV-HA/SHG-44)、反义β-1,4-GalTV(GalTV-AS/SHG-44)和空载体(Mock)的SHG-44细胞后细胞的凋亡和死亡情况。结果:①低浓度的VP16(20μmoL/L)处理24h后,GalTV-HA/SHG-44组的死亡细胞加上凋亡细胞的比例明显低于Mock组(t=4.5506,P<0.01)和GalTV-AS/SHG-44组(t=5.0865,P<0.001)。GalTV-AS/SHG-44组的死亡细胞加上凋亡细胞比例明显高于Mock组(t=3.2873,P<0.01)。高浓度的VP16(120μmoL/L)处理48h和72h后,GalTV-HA/SHG-44组死细胞所占比例明显低于Mock组t=3.3664,(P<0.05;t=5.4953,P<0.01)和GalTV-AS/SHG-44组(t=3.1732,P<0.01;t=4.6035,P<0.001)。②MTT分析显示,VP16处理48,72h后,GalTV-HA/SHG-44组活细胞数明显高于Mock组(t=5.0783,P<0.05;t=3.8923,P<0.01)和GalTV-AS/SHG-44组(t=4.5667,P<0.01;t=4.7849,P<0.001)。③VP16(20μmoL/L)处理24h后,用Hoechst33258染色。镜下观察到死亡或者凋亡细胞中的细胞核     

鬼臼乙叉甙对SHG-44胶质瘤细胞表达β-1,4-半乳糖基转移酶Ⅴ后粘附相关分子表达的影响

目的　研究人脑星形胶质细胞瘤SHG 4 4细胞表达 (β 1,4 半乳糖基转移酶Ⅴ (beta 1,4 galactosyltransferaseⅤ ,β 1,4 GalTⅤ )后对化疗药物敏感性的影响 ,分析鬼臼乙叉甙 (VP16 )处理表达 β 1,4 半乳糖基转移酶Ⅴ的SHG 4 4细胞后其细胞粘附作用相关因子水平的变化。方法　用 12 0 μmol/L的VP16处理转染了正义、反义 β 1,4 GalTⅤ和空载体的SHG 4 4细胞 2 4h后 ,采用westernblot检测整合蛋白 β1表达变化及局部粘着斑激酶 (focaladhesionkinase,FAK)的蛋白水平和FAK的酪氨酸磷酸化水平。结果　在未经VP16处理的 3株SHG 4 4细胞中 ,FAK的蛋白水平没有明显改变 ,而整合蛋白 β1的蛋白表达在转正义 β 1,4 GalTⅤ的细胞中最高 ;经VP16处理后 ,SHG 4 4细胞中整合蛋白β1的表达水平增高 ,FAK及其磷酸化水平下降。但整合蛋白β1,FAK及其磷酸化水平随细胞中 β 1,4 GalTⅤ表达水平不同而变化。 结论　VP16处理对表达不同水平的β 1,4 GalT Ⅴ的SHG 4 4胶质瘤细胞的粘附影响有所不同 ,提示胶质瘤表达 β 1,4 GalTⅤ不仅与肿瘤的恶性行为有关 ,而且与肿瘤的化疗敏感性有关。     

正、反义β-1,4-半乳糖基转移酶V表达质粒在星形胶质细胞瘤细胞中的转染与鉴定

目的：构建β-1，4-半乳糖基转移酶-V(β-1，4-GalTV)正、反义表达质粒，并将其转染到人脑星形胶质细胞瘤细胞SHG-44中，为探讨神经胶质瘤细胞表达β-1，4-GalTV的生物学意义提供研究基础。方法：构建β-1，4-GalTV表达质粒，并将其转染到人脑星形胶质细胞瘤细胞SHG-44中；用Western印迹和Northern印迹鉴定转染情况。结果：通过酶切鉴定和测序分析，实验成功构建β-1，4-GalTV表达质粒。将构建的表达质粒转染到胶质细胞瘤细胞SHG-44中，经鉴定表明，转染的正义表达质粒能增加胶质细胞瘤细胞SHG-44中的β-1，4-GalTV表达量，而转染反义质粒则能降低细胞中β-1，4-GalTV表达量。结论：正、反义β-1，4-GalTV表达质粒在人脑星形胶质细胞瘤细胞SHG-44中的稳定转染和表达，对分析胶质瘤细胞表达β-1，4-GalTV的意义如对肿瘤细胞的增殖、迁移和黏附等的影响提供了研究基础。