二甲基三十六烷基铵及卡介苗多糖核酸佐剂在结核亚单位疫苗加强BCG免疫中的效应研究

Objective To investigate the adjuvant effect of dimo-thylidioctyl ammonium bromide (DDA) and/or DDA-BCG polysaccharide nucleic acid( BCG-PSN), which was combined with a Mycobacterium tuberculosis fusion protein AMM ( Ag 8 5 B - MPT64190-198 - Mtb8.4 ) to boost BCG primed immunization. Methods DDA with or without BCG PSN was mixed with the fusion protein AMM to construct the boosting vaccine. Mice were immunized with BCG and then boosted twice with AMM formulated with the adjuvant DDA with or without BCG-PSN. PBS or BCG vaccination without boosting was used as control. The humoral and cell-mediated immune responses were analyzed by ELISA and ELISPOT. Moreover, the protective efficacy of BCG prime-AMM subunit vaccine boosting against Mycobacterium tuberculosis infection was analyzed. Results With in vitro stimulation of Ag85B and PPD( purified protein derivative) antigen, the number of IFN-γ secreting cells from the mice boosted twice by AMM/DDA/BCG-PSN and AMM/DDA were higher than BCG and PBS group (P <0.05). The CFU in lungs of mice boosted with AMM/DDA/BCG-PSN was less than that of PBS group(P <0.05), while the CFU of AMM/DDA-boosted mice was less than that of BCG and PBS group(P < 0.05).However, fewer lesions were seen in lungs of mice immunized with BCG alone or BCG-prime-AMM/DDA/BCG-PSN boosting than the other groups. Conclusion DDA is an idea adjuvant for tuberculosis subunit vaccine;BCG-PSN might play a role in alleviating the immunity-mediated pathology.     

结核分枝杆菌抗原Ag85B-Mpt64190-198-HspX融合蛋白免疫原性的初步观察

目的 为了建立对潜伏感染细菌的保护性免疫应答,本研究选择结核分枝杆菌休眠期、对数生长期最重要的保护性抗原HspX、Mpt64的190～198位的氨基酸多肽(CD8+T细胞表位)及Ag85B,构建融合蛋白Ag85B-Mpt64190-198-HspX(AMH),并对其免疫原性进行研究.方法 PCR分别扩增Ag85B、Mpt64190-198-HspX基因,并依次插入pET-28a质粒中,在大肠杆菌BL21中表达纯化AMH蛋白.将该蛋白和佐剂二甲基三十六烷基铵和卡介苗多糖核酸(DDA+BCG-PSN)混合构建亚单位疫苗,分别于1、4、7周皮下免疫C57BL/6小鼠3次,最后一次免疫5周后检测体液免疫与细胞免疫反应.结果 该融合蛋白以包涵体形式能在大肠杆菌中稳定表达,经Ni-NTA层析柱纯化得到纯度较高的蛋白;构建的亚单位疫苗免疫动物能产生针对结核杆菌特定抗原(PPD、Ag85B、Mpt64190-198和HspX)的特异性的细胞免疫和体液免疫应答,具有较强的免疫原性.结论 融合蛋白AMH作为结核亚单位疫苗候选的融合蛋白抗原有必要进一步研究.     

二甲基三十六烷基铵及卡介苗多糖核酸佐剂在结核亚单位疫苗加强BCG免疫中的效应研究

Objective To investigate the adjuvant effect of dimo-thylidioctyl ammonium bromide (DDA) and/or DDA-BCG polysaccharide nucleic acid( BCG-PSN), which was combined with a Mycobacterium tuberculosis fusion protein AMM ( Ag 8 5 B - MPT64190-198 - Mtb8.4 ) to boost BCG primed immunization. Methods DDA with or without BCG PSN was mixed with the fusion protein AMM to construct the boosting vaccine. Mice were immunized with BCG and then boosted twice with AMM formulated with the adjuvant DDA with or without BCG-PSN. PBS or BCG vaccination without boosting was used as control. The humoral and cell-mediated immune responses were analyzed by ELISA and ELISPOT. Moreover, the protective efficacy of BCG prime-AMM subunit vaccine boosting against Mycobacterium tuberculosis infection was analyzed. Results With in vitro stimulation of Ag85B and PPD( purified protein derivative) antigen, the number of IFN-γ secreting cells from the mice boosted twice by AMM/DDA/BCG-PSN and AMM/DDA were higher than BCG and PBS group (P <0.05). The CFU in lungs of mice boosted with AMM/DDA/BCG-PSN was less than that of PBS group(P <0.05), while the CFU of AMM/DDA-boosted mice was less than that of BCG and PBS group(P < 0.05).However, fewer lesions were seen in lungs of mice immunized with BCG alone or BCG-prime-AMM/DDA/BCG-PSN boosting than the other groups. Conclusion DDA is an idea adjuvant for tuberculosis subunit vaccine;BCG-PSN might play a role in alleviating the immunity-mediated pathology.     

卡介苗增强人肺腺上皮细胞β-防御素-1基因的转录

目的 :检测卡介苗 (BCG)胞壁蛋白对人 β 防御素 1 (hBD 1 )基因表达的影响 ,并初步分析该基因 5′ 端旁侧区中的BCG作用元件。方法 :经SephadexG 1 5 0层析柱分离得到BCG细胞壁蛋白组份。用逆转录多聚酶链反应 (RT PCR)和Northern杂交分析法检测hBD 1mRNA在肺腺上皮细胞的表达。一系列逐渐缩短的hBD 1基因 5′ 端序列被连接入无启动子的pCATBasic质粒 ,构建了CAT报告质粒。ELISA法检测报告基因表达。结果 :热灭活的BCG全菌( 5 0mg/L)及分子量在 1 8kDa～ 30kDa的胞壁蛋白组份 ( 3mg/L)刺激SPC A 1细胞 8h后 ,hB…     

结核分枝杆菌耐乙胺丁醇诊断试验的系统评价

目的系统评价各种检测结核分枝杆菌耐乙胺丁醇诊断试验方法的准确性。方法计算机检索PubMed、EMbase等数据库,并手工检索相关期刊,全面收集结核分枝杆菌耐乙胺丁醇诊断试验的研究,依据QUADAS评价纳入诊断试验的质量,并对结果进行Meta分析。结果最终纳入9个研究。Meta分析结果显示：硝酸盐还原法与比例法相比,以及BACTEC MGIT 960与BACTEC 460 TB相比,其敏感度、特异度、阳性似然比、阴性似然比及SROC曲线下面积分别为92%、99%、30.50、0.13、0.9752和93%、92%、6.27、0.11、0.9;MB/BacT,噬菌体生物扩增法亦显示了较好的检验效能。结论硝酸盐还原试验可代替比例法作为结核分枝杆菌耐乙胺丁醇的筛查试验;BACTEC MGIT 960可代替BACTEC 460检测系统作为结核分枝杆菌耐乙胺丁醇的确诊试验。     

细粒棘球绦虫Eg95重组分泌型卡介苗的构建

目的 构建细粒棘球绦虫Eg95重组分泌型卡介苗(rsBCG-Eg95)。 方法 分别以卡介苗BCG基因组DNA和pGEX-4T-Eg95重组质粒为模板, PCR扩增获117 bp 的BCG抗原85B(BCG-Ag85B)信号肽序列和 471 bp 的Eg95基因序列。将这两个序列定向克隆至大肠埃希菌-BCG穿梭质粒pMV261, 经酶切、 PCR扩增及测序鉴定得到重组质粒pSMEg95。电穿孔法将重组质粒导入BCG菌构建rsBCG-Eg95疫苗, 卡那霉素抗性基因筛选并经PCR扩增鉴定。 结果质粒pSMEg95经双酶切、 PCR扩增及测序鉴定, 证实克隆基因Ag85B信号肽和Eg95基因序列正确插入载体pMV261, 并将此重组质粒导入BCG菌, 经PCR扩增鉴定证实细粒棘球绦虫Eg95重组分泌型卡介苗 (rsBCG-Eg95)构建成功。 结论 构建了含有BCG信号肽Ag85B和保护性抗原Eg95基因序列的细粒棘球绦虫Eg95重组分泌型卡介苗rsBCG-Eg95。     

体外分枝杆菌培养系统检测结核分枝杆菌耐受利福平的系统评价

用Meta-analysis方法评价非放射性分枝杆菌培养系统检测结核分枝杆菌耐受利福平的准确性。通过检索PubMed、EMBASE、CBMWeb、CSJD、CJFD数据库和其他方式广泛收集文献。用QUADAS（Quality Assessment of Diagnostic Accuracy Studies）标准评价文献质量。用Meta-Disc软件计算合并灵敏度、合并特异性和SROC曲线等评价非放射性分枝杆菌培养系统的诊断正确性。最终纳入6篇文献。非放射性分枝杆菌培养系统在检测结核分枝杆菌耐受利福平时,均显示了较高的灵敏度和特异性。MB／BacT系统的合并灵敏度=100％,合并特异性=99％。BACTEC MGIT 960检测系统的平均灵敏度：100％,平均特异性：91％,SROC曲线下面积为0．997。结论：MB／BacT和BACTEC MGIT 960系统在检测结核分枝杆菌耐药（利福平）性方面显示了较高的灵敏度和特异性。推荐使用MB／BacT和BACTEC MGIT 960系统代替BACTEC 460检测系统作为结核分枝杆菌耐药（利福平）性的确诊试验。限于纳入研究的局限性,手工操作的分枝杆菌生长指示管（MGIT）系统的检验效能还有待进一步研究。     

二甲基三十六烷基铵及卡介苗多糖核酸佐剂在结核亚单位疫苗加强BCG免疫中的效应研究

目的 探讨二甲基三十六烷基铵(dimo-thylidioctyl ammonium bromide,DDA)和卡介苗多糖核酸(BCC-PSN)佐剂在结核融合蛋白疫苗加强卡介苗(BCG)免疫中的不同免疫辅助效应.方法 选择DDA、BCG-PSN作为融合蛋白AMM(Ag85B-MPT64190-198-Mtb8.4)的佐剂,在BCG初免小鼠后,AMM疫苗加强免疫两次,其中一组联合使用两种佐剂(DDA/BCG-PSN),另一组单独以DDA作为佐剂,同时设立BCG或磷酸缓冲液(PBS)免疫组为对照.应用ELISA及ELISPOT检测免疫小鼠的体液与细胞免疫反应,最后一次加强免疫后第12周,以H37Rv尾静脉攻毒并检测小鼠肺脾组织细菌载量和病理改变,评价不同佐剂疫苗的保护效果.结果 在BCG初免基础上,联合佐剂组(AMM/DDA/BCG-PSN)和单独佐剂组(AMM/DDA)加强免疫两次后,脾脏淋巴细胞经抗原Ag85B和PPD(purified protein derivative)刺激后,皆可产生分泌较BCG组高的IFN-γ.毒力株攻击后菌落形成单位(colony-forming unit,CFU)计数显示,联合佐剂组(AMM/DDA/BCG-PSN)脾脏荷菌量少于PBS组和BCG组(P<0.05);而单独佐剂组(AMM/DDA)肺部荷菌量少于PBS组和BCG组(P<0.05).组织病理分析结果 表明AMM/DDA/BCG-PSN组肺组织病理损伤较轻,而AMM/DDA组病理损伤个体差异较大.结论 DDA是较为理想的结核亚单位疫苗佐剂,能诱导较强的细胞免疫和免疫保护作用;BCG-PSN可能具有免疫调节作用,可以减轻免疫病理损伤.     

CFP21-ELISPOT方法的建立及其在结核分枝杆菌感染诊断中的应用

目的用酶联免疫斑点试验(enzyme-linked immunospot assay,ELISPOT)评价检测CFP21蛋白在结核分枝杆菌感染中的诊断效果,同时,比较CFP21、CFP10和ESAT6的应用价值。方法取28例临床确诊结核患者和26例健康志愿者外周血,分离单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs),用CFP21、CFP10和ESAT6蛋白刺激,定量检测PBMC分泌的特异性γ干扰素(IFN-γ)水平,判断结核分枝杆菌感染情况。用ELISA检测血清抗结核抗体。结果 ELISA检测结核病患者血清结核抗体阳性率为57.1%;以CFP21、CFP10和ESAT6为抗原,用ELISPOT方法检测结核病患者IFN-γ阳性率分别为25.0%、39.3%和32.1%。结论应用CFP21蛋白作为抗原建立的ELISPOT方法有潜在的临床应用价值,但CFP21作为抗原用于结核分枝杆菌感染诊断的敏感性低于CFP10和ESAT6。     

肿瘤干细胞及其分离鉴定

 肿瘤干细胞（TSC）是肿瘤组织中充当干细胞角色的细胞,具有无限增殖的潜能,在启动肿瘤形成和生长中起着决定性的作用。从血液系统肿瘤和实体瘤研究获得的数据提示,在每一个癌组织内只有一小部分的细胞群具有这样启动肿瘤演进的能力,这些肿瘤起始干细胞承担着肿瘤干细胞或癌干细胞的特定功能,而其余的大多数细胞则经过短暂的分化,最终死亡。近年来随着干细胞和TSC的深入研究,越来越多的证据表明TSC是恶性肿瘤转移复发的原因,因此分离鉴定出TSC对阐明肿瘤发病机制和研发抗肿瘤药物具有重要意义。目前分选技术尚未成熟,主要是利用TSC的生物学和表面标记,采用高效的流式细胞仪和磁性细胞分选仪分选TSC或干细胞样细胞,判断其是否具备自我更新与增生分化的能力。TSC的鉴定现在通常用的验证手段包括根据特异的细胞表面标志鉴定TSC,采用染料Hoechst 33342鉴定TSC,采用BrdU法鉴定TSC及利用TSC的生物学特性在体外培养进行初步的鉴定等。但是进行TSC鉴定的最具说服力的方法主要是根据细胞体内成瘤能力鉴定TSC。