抑制Her-2基因的表达对NK-92细胞杀伤SKOV3细胞活性影响的研究

目的:探讨抑制Her-2基因的表达对NK-92细胞杀伤SKOV3细胞活性的影响。方法:Her-2siRNA质粒在脂质体介导下转染到包装病毒细胞株PT67中,将病毒上清转染SKOV3,经嘌呤霉素筛选得到稳定抑制Her-2基因表达的SKOV3/siRNA-1、SKOV3/siRNA-2细胞株,并分别通过RT-PCR和免疫组化法鉴定抑制Her-2表达的效果。应用LDH法检测NK-92细胞对SKOV3、SKOV3/siRNA-1、SKOV3/siRNA-2、SKOV3/siRNA-neg-ative control的杀伤活性。结果:Her-2/siRNA-1、Her-2/siRNA-2均可有效沉默Her-2mR-NA和蛋白的表达。NK-92细胞对SKOV3、SKOV3/siRNA-negative control的杀伤率分别为21%、20%,而对SKOV3/siRNA-1、SKOV3/siRNA-2的杀伤率分别为33%、45%(P<0·05)。结论:抑制Her-2基因的表达可增强NK-92细胞对SKOV3细胞的杀伤活性。RNA干扰技术联合NK-92细胞为高表达Her-2基因卵巢癌的生物治疗提供了一种新的策略。     

抗vWF与GPIb-IX结合部位的噬菌体呈现型单链抗体制备及功能研究

目的：为了研制新型特异性抗血栓制剂。方法：利用噬菌体展示文库技术筛选与vWF-A1区有高亲合力单链抗体(ScFv)；基因重组的方法构建高效表达载体pET-20b( )-ScFv，在大肠杆菌中诱导表达；夹心ELISA方法鉴定此单抗的抗原结合活性；瑞斯脱霉素诱导的血小板聚集试验(RIPA)测定ScFv对血小板聚集的抑制作用。结果：噬菌体展示技术筛选的ScFv在大肠杆菌中成功地诱导表达，表达的ScFv占菌体总蛋白的41％，以包涵体形式存在；经纯化复性的ScFv可以与。vWF、rvWF-A1、rvWF-A1/／A3结合，但不与rvWF-A3、BSA反应；ScFv具有抑制RIPA功能，抑制率为73．7％。结论：在大肠杆菌中高效表达的噬菌体展示技术筛选的抗vWF-A1区ScFv可特异性与vWF-A1区结合，而抑制瑞斯脱霉素诱导的血小板聚集，显示出很好的应用前景，为研制新型抗栓药物奠定基础。     

流式细胞术检测单个淋巴细胞内细胞因子表达及其临床应用

目的　寻找一种准确、敏感的检测 T淋巴细胞内细胞因子水平的方法 ,为研究 T细胞极化状态在疾病发生发展过程中的作用提供可靠的手段。　方法　用 PMA、 ionomycin作刺激剂 ,刺激全血中淋巴细胞表达细胞因子 ,以 mon-ensin阻断细胞因子分泌至胞外 ,应用两种免疫荧光抗体同时标记淋巴细胞的膜表面特异的分子和表达并被阻滞在胞内的细胞因子 ,然后用流式细胞仪进行检测和分析。　结果　本方法检测 1 8例正常人淋巴细胞的分泌细胞因子水平 ,其中CD4 + T淋巴细胞中 Th1占 1 9.5 1 %± 4 .96% ,Th2占 1 5 .66%± 3.95 % ;CD8+ T淋巴细胞中 Tc1占 1 6.2 2 %± 1 .78% ,Tc2占 9.2 0 %± 1 .96% ;而 1 2例妊高征孕妇的 Th1、Tc1百分比例明显高于正常人 ( P<0 .0 1 ) ,Th2的比例显著低于正常人( P<0 .0 1 )。　结论　双抗体标记流式细胞仪检测法可以客观、准确地检测淋巴细胞表达细胞因子的水平 ,判断 T淋巴细胞的极化状态。妊高征患者与正常人相比存在 T淋巴细胞的极化水平异常 ,可能与妊高征的发生发展有关     

靶向Her2基因SiRNA对人卵巢癌细胞株SKOV-3 顺铂敏感性的影响

目的通过siRNA沉默Her2基因的表达探讨其对卵巢癌细胞株SKOV-3顺铂（DDP）敏感性的影响。方法靶向Her2的siRNA通过阳离子脂质体介导转染到SKOV-3中,经过嘌呤霉素筛选得到稳定抑制Her2基因表达的SK-OV-3细胞株,通过RT-PCR方法检测各组SKOV-3细胞Her2基因的表达。应用四甲基偶氮唑蓝检测DDP对各组SKOV-3细胞增殖水平的影响,应用膜联蛋白V异-硫氰酸荧光素细胞凋亡试剂盒在流式细胞仪上检测DDP作用后各组SKOV-3细胞凋亡水平。结果建立了稳定抑制Her2基因表达的细胞株,SKOV3/siRNA-1组和SKOV3/siRNA-2组细胞Her2基因表达分别为对照组的53.8%和38.4%,而空载体组为92.3%。在DDP作用下SKOV3/siRNA-1和SKOV3/siRNA-2的细胞存活率在4 d时分别为67.7%±4.4%和66.4%±3.3%,与未转染对照组81.7%±1.3%和空载体组81.3%±1.4%比较差异有显著性（P〈0.05）。FCM分析显示SK-OV3/siRNA-1和SKOV3/siRNA-2细胞的DDP诱导凋亡率分别为38.6%±1.1%和42.8%±1.4%,明显高于未转染组9.1%±0.8%和空载体组8.8%±0.7%,差异有显著性（P〈0.05）。结论靶向Her2基因的siRNA可以增强卵巢癌细胞株SKOV-3对DDP的敏感性。     

端粒酶活性在口腔鳞状细胞癌中的表达研究

目的　了解端粒酶活性在口腔鳞状细胞癌中的表达情况并探讨端粒酶活性在口腔鳞状细胞癌演变过程中的作用。方法　对 37例口腔鳞状细胞癌、2 0例癌前病变 (白斑 )、15例口腔良性肿瘤 (乳头状瘤 )及 12例正常口腔组织 ,采用聚合酶链反应 -酶联免疫吸附法检测其端粒酶活性。结果　口腔鳞状细胞癌中的端粒酶活性阳性率明显高于良性肿瘤组织和正常组织。口腔癌前病变组与鳞状细胞癌组基本一致。结论　端粒酶可稳定染色体末端的端粒结构,端粒酶活化在口腔肿瘤恶变过程中起重要作用;端粒酶可作为判断癌变能力的良好分子生物学标志。     

非血缘脐血干细胞移植和同胞外周血干细胞移植免疫重建与慢性移植物抗宿主病的研究

目的:探究恶性血液病患者非血缘脐血干细胞移植（UCBT）和同胞外周血干细胞移植（PBSCT）后免疫重建与慢性移植物抗宿主病（cGVHD）的关系。方法:以2018年3月至2019年8月在中国科学技术大学附属第一医院行UCBT（96例）和PBSCT（28例）的患者为研究对象。采用流式细胞术检测两组患者移植后第1、3、6、9...     

病毒性肝炎患者血清中TNF和IL-6的检测及其临床意义

目的 探讨细胞因子ＴＮＦ、ＩＬ－６与病毒性肝炎发生的相关性．方法 应用双抗体夹心ＥＬＩＳＡ方法检测患者血清中ＴＮＦ、ＩＬ－６,并用全自动生化分析仪检测肝功能．结果 肝炎患者血清中 ＴＮＦ、ＩＬ－６均明显高于对照组,Ｐ＜０．０１;而且ＴＮＦ含量与ＡＬＴ呈正相关,ＩＬ－６与球蛋白水平呈正相关．结论ＴＮＦ、ＩＬ－６与病毒性肝炎发生的病理过程有关,可能参与肝细胞的损伤过程．     

口腔鳞状细胞癌中端粒酶活性的表达

目的 了解端粒酶活性在口腔鳞状细胞癌中的表达情况,并探讨端粒酶活性在口腔鳞状细胞癌演变过程中的作用。方法 对３７例口腔鳞状细胞癌、４０例口腔良性肿瘤及１２例正常口腔组织,采用聚合酶链反应－酶联免疫吸附法检测其端粒酶活性。结果 口腔鳞状细胞癌组的端粒酶活性阳性率明显高于良性肿瘤组和正常组织组。结论 端粒酶可稳定染色体末端的端粒结构,端粒酶活化在口腔肿瘤恶变过程中起了重要作用;端粒酶可作为判断癌变能力     

荧光定量PCR法检测肿瘤细胞株转录因子表达水平

目的 建立荧光定量聚合酶链反应(fluorogenic quantitative PCR)检测方法，以便快速、准确地定量检测细胞株转录因子表达强度。方法 根据基因序列，设计合成引物．采用一步法提取细胞株总RNA，逆转录获取cDNA，通过荧光定量的方法对各细胞株的转录因子T—box expression in Tceils(T—bet)，GATA3的表达水平进行检测。结果 细胞株NK92、QBC939、K562、HO-8910、A549、HeLa转录因子T—bet的表达强度分别为0．90、1．25、0．96、0．92、1．1l和1．17，GATA3的表达强度分别为1．23、1．49、1．30、0．97、1．05和1．34。结论 建立丁肿瘤细胞株转录因子基因表达的荧光定量PCR检测方法，较常规PCR方法更为简便、快速、准确，有很好的应用前景。     

人von Willebrand因子A1区基因的克隆和表达

为了深入研究血栓形成的机制以及开发新的抗血栓药物 ,将人vonWillebrand(vWF)因子A1区cDNA在大肠杆菌中表达 ,以获得高效表达的具有生物学活性的重组A1区蛋白 ,应用PCR方法从含有人全长vWFcDNA质粒中扩增A1区基因片段 ,并将其克隆至pUCm T载体中 ,经DNA序列分析后 ,将其重组于有 6×HisTag的融合蛋白表达载体pQE 31中 ,并在大肠杆菌M1 5中诱导表达。采用Ni NTA柱进行纯化 ,用Western印迹鉴定。结果表明 ,PCR扩增得到 854bp的A1区基因片段 ,序列测定结果与文献报道一致。IPTG诱导 5小时后表达的vWF因子A1蛋白占菌体总蛋白的 30 %左右 ,经Ni NTA纯化后其纯度在 95 %以上。Western印迹检测显示A1蛋白具有很好的抗原性和特异性。结论 :成功地在大肠杆菌中高效表达了人vWFA1区蛋白 ,为进一步研究vWF在血栓形成与止血中的作用奠定了基础