FLT3靶向短发夹状干扰RNA体外转录合成及作用

FMS样酪氨酸激酶3（FLT3）是一种酪氨酸激酶受体,在大多数急性髓系白血病（AML）患者中持续激活,与患者预后差密切相关。为探讨3种FLT3靶向短发夹状干扰RNA（shRNA）对急性髓系白血病细胞株THP-1的沉默效应,设计和体外转录合成3个FLT3靶向shRNA（shRNA1、shRNA2、shRNA3）,体外转染THP-1细胞;以RT-PCR法检测FLT3mRNA水平表达,用流式细胞术、免疫荧光测定法检测FLT3蛋白的表达。结果显示：shRNA1、shRNA3可显著下调FLT3mRNA的表达,其中shRNA1的抑制作用较强。25nmol/LshRNA1转染48小时对FLT3mRNA的抑制率是（72.95±2.07）%,作用可达72小时。5nmol/L及以上浓度的shRNA1对FLT3mRNA表达有下调作用,作用存在量-效关系。15nmol/LshRNA1的抑制率是（67.53±0.66）%。FLT3蛋白位于细胞膜上,shRNA1对其有较强的抑制作用,转染72小时蛋白抑制率达（79.67±0.66）%。结论：FLT3-shRNA1具有较好的FLT3基因靶向抑制作用,可作为进一步研究该基因作用机制及靶向治疗可能性的工具。     

虎杖苷对THP-1细胞增殖及凋亡的影响及其作用机制研究北大核心CSCD

目的探讨虎杖苷对急性单核细胞白血病细胞株THP-1增殖及凋亡的影响及可能的作用机制。方法以不同梯度浓度的虎杖苷处理THP-1细胞24 h、48 h,CCK-8法检测细胞增殖活力,并计算半数抑制浓度。取对数生长期的THP-1细胞,分为虎杖苷处理组(处理浓度为半数抑制浓度)和空白对照组(细胞中未施加虎杖苷溶液处理),培养48 h后,采用流式细胞术检测细胞凋亡及细胞周期;Western blot法检测PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、p70 S6K、p-p70 S6K蛋白的表达。结果虎杖苷可有效抑制THP-1细胞的增殖,48 h的半数抑制浓度为1800μmol/L。经1800μmol/L的虎杖苷溶液作用48 h后,THP-1细胞的凋亡率较空白对照组显著增加(P<0.05);细胞周期出现G0/G1期至S期的阻滞,表现为G0/G1期的细胞比例较空白对照组明显上升,S期的细胞比例较空白对照组显著下降(P<0.05);PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、p70 S6K、p-p70 S6K蛋白表达较空白对照组显著降低(P<0.05)。结论虎杖苷可有效抑制THP-1细胞的增殖,阻滞细胞周期并诱导细胞凋亡,其作用机制可能与PI3K/AKT/mTOR信号通路的抑制表达有关。     

急性白血病患儿血清转铁蛋白受体与铁参数变化的研究

血清转铁蛋白受体 (ｓＴｆＲ)是细胞转铁蛋白受体 (ＴｆＲ)的可溶性片段 ,一定程度上可反映细胞ＴｆＲ的数量。已知ＴｆＲ在红系细胞、高度增殖细胞 (包括肿瘤细胞 )和低分化细胞表达较高 ,我们结合铁指标观察了白血病患者ｓＴｆＲ的变化水平。对象和方法1　对象　 2 0 0 0年 9月～ 2 0 0 1年 7月我院住院急性白血病患儿 4 8例 ,其中男 2 8例 ,女 2 0例 ,平均年龄 7.2岁。急性淋巴细胞白血病 (ＡＬＬ) 37例 ,其中Ｌ1 型 30例 ,Ｌ2 型 7例。初治者2 4例 ,其中入院治疗 4周内骨髓缓解者 14例 ,10例进行了动态检测至化疗第 8周末。已完全缓解 6…     

三氧化二砷诱导K562细胞凋亡机制的研究

目的了解三氧化二砷(As2O3)诱导慢粒细胞系K562细胞株凋亡是否与线粒体跨膜电位(mitochondrial transmembrane potentials,△ψm)改变有关及其可能机制。方法联合应用As2O3、DTT和BSO处理K562细胞株,通过细胞内荧光染料PI/Rh123的色强度分析(△ψm),测定细胞活力、亚G1期细胞含量及形态学观察等鉴定细胞凋亡。结果As2O3可明显诱导K562细胞线粒体△ψm下降。BSO可加强As2O3诱导的K562细胞凋亡和线粒体△ψm下降,而DTT则有部分拮抗作用。在2×10-6mol/L As2O3处理72h的K562细胞,PI-Rh123-细胞达(26.0±2.5)%,当1×10-3mol/LBSO同时处理时,PI-Rh123-细胞和凋亡细胞数上升达(37.2±5.7)%和(39.1±4.5)%;而当2×10-4mol/L DTT同时处理时,PI-Rh123-细胞和凋亡细胞数分别降至(11.5±1.3)%和(15.4±3.5)%。结论线粒体跨膜电位下降是As2O3诱导K562细胞凋亡的关键环节,其机制可能与巯基氧化有关,巯基可能是As2O3凋亡细胞的重要靶分子。     

免疫共沉淀检测人p65和SMRT蛋白间相互作用

目的 使用免疫共沉淀技术法检测人p65和SMRT蛋白在儿童急性髓细胞白血病（AML）细胞株THP-1中相互作用。方法 体外人工合成p65基因CDS区碱基序列和SMRT-C 645bp对应的基因片段,分别克隆至pUC57载体,经酶切、测序正确后,PCR扩增目的基因片段,酶切后亚克隆至带有HA标签和Myc标签的真核表达载体pCMV-HA和pCMV-Myc,测序、酶切鉴定正确后,共转染THP-1细胞,免疫共沉淀法检测二者间相互作用。结果 成功构建了人p65和SMRT蛋白真核表达载体pCMV-HA-p65和pCMV-Myc-SMRT,共转染THP 1细胞,抗HA和Myc多克隆抗体分别沉淀细胞裂解液,用抗Myc和HA单克隆抗体分别进行Western Blotting检测,可以检测到HA-p65和Myc-SMRT蛋白的表达。结论 成功构建了人p65和SMRT蛋白重组真核表达载体,在THP-1细胞株中表达后,免疫共沉淀证实p65和SMRT蛋白间存在相互作用,为进一步探讨儿童AML发病机制和白血病的靶向治疗提供理论依据。     

汉族人群微卫星DXS16遗传多态性

目的获得X染色体短串联重复序列DXS16遗传多态性在河南汉族人群中的分布状况。方法应用聚合酶链反应,变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel ectrophoresis,PAGE）及银染色技术对110名无血缘关系的汉族个体DXS16基因座进行分型。结果观察到DXS16位点有14个等位基因片段,该STR位点的基因型分布符合Hardy—Weinberg平衡;杂合度为0．88,多态信息含量为0．885。结论DXS16在汉族人群中有较好的多态性分布;实验数据对X染色体特异性STR的群体遗传学研究及一些X连锁遗传病的基因诊断有重要意义。     

儿童过敏性紫癜相关病原体检测

过敏性紫癜也称亨一舒综合征（Henoch—Schon—lein purpura,HSP）,是一种儿童常见的系统性血管炎性综合征,多发于学龄前和学龄儿童,其发病呈逐年增多趋势。HSP的发病机制目前仍未明确,感染常常是HSP的诱发因素。为探讨HSP与病原体感染的关系,指导临床治疗,作者检测了50例HSP患儿和50例健康对照儿童9种病原体的感染情况,现报道如下。     

五种急性髓细胞白血病细胞株FAM样酪氨酸激酶3表达及其短状串联重复突变检测

目的:探讨不同急性髓细胞白血病细胞(AML)FAM样酪氨酸激酶3(FLT3)表达状况,筛选FLT3过表达细胞,并检测其编码FLT3近膜(JM)区的基因是否存在短状串联重复(ITD)突变.方法:选择THP-1、K562、HL-60、Dami、Meg-01细胞,以含内参GAPDH对照的半定量RT-PCR检测其FLT3 mRNA的表达,以流式细胞仪检测细胞膜表面FLT3蛋白的表达;提基因组DNA,PCR扩增其JM区,对有FLT3过表达的细胞,PCR扩增产物连T-载体后测序.结果:5种AML细胞中仅有THP-1、HL-60存在FLT3基因的表达,其mRNA表达相对于GAPDH的含量分别是0.83±0.07、0.48±0.05,2者比较差异有统计学意义(t=7.047,P＜0.01);细胞膜表面FLT3蛋白表达率分别是(43.55±4.44)%、(27.57±3.42)%,2者比较差异有统计学意义(t=8.029,P＜0.001).2种细胞经FLT3-JM区PCR产物测序均不存在ITD突变.结论:THP-1、HL-60是FLT3野生型过表达的AML细胞株.     

虎杖苷对神经母细胞瘤细胞增殖及凋亡的影响

目的:探讨虎杖苷对神经母细胞瘤细胞增殖及凋亡的影响及机制。方法:以不同梯度浓度的虎杖苷处理神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞24、48和72 h, CCK-8法检测细胞增殖,并计算其IC₅₀。1 120.00μmol/L的虎杖苷处理SH-SY5Y细胞72 h后(以不加虎杖苷处理为空白对照组),采用Annexin V-FITC/PI染色检测细胞凋亡,流式细胞术检测细胞周期;Western blot检测PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、p70 S6K、p-p70 S6K蛋白的表达。结果:虎杖苷可有效抑制SH-SY5Y细胞的增殖,72 h的IC₅₀为1 120.00μmol/L。与空白对照组相比,1 120.00μmol/L的虎杖苷作用72 h后,SH-SY5Y细胞凋亡率增加(P<0.05);细胞周期中S期的细胞比例增高(P<0.05),G₀/G₁期细胞比例下降(P<0.05);PI3K、AKT、p-AKT、p-p70 S6K蛋白表达降低(P<0.05),而mTOR...     

免疫抑制疗法治疗儿童再生障碍性贫血疗效分析

目的：探讨免疫抑制疗法(IST)治疗儿童再生障碍性贫血(AA)的疗效、安全性及影响疗效的主要因素。方法：对2007年1月至2010年12月接受IST治疗的55例重型再生障碍性贫血（SAA）及51例慢性再生障碍性贫血（CAA）患儿的临床资料进行回顾性分析。结果：① 在CAA患儿中,抗胸腺球蛋白（ATG）联合环孢素A（CsA）治疗组总有效率明显高于CsA单独治疗组(80％ vs 44％,P40%、治疗前无重症感染以及有G-CSF早期治疗反应的患儿治疗效果较好,而治疗效果与AA分型、年龄等指标无关。结论：ATG+CsA联合治疗是治疗儿童AA的一种安全有效的方法;病程长短、有无严重感染、骨髓造血面积及G-CSF早期治疗反应是影响疗效的主要因素。