环介导等温扩增技术的研究进展和微生物检测应用

环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification, LAMP）是一种新型的核酸扩增技术。本文概述其反应原理、技术特点、相关技术、微生物检测应用及发展前景。     

比格犬雌激素受体β的原核表达、纯化及鉴定

目的 研究比格犬雌激素受体β(Estrogen receptor β,ERβ)及其剪接异构体在生殖调控中的功能,构建比格犬ERβ的pMAL-p5x/ERβ 480 DE3 E.coli重组菌株,并进行纯化和鉴定.方法 Trizol法提取发情期比格犬下丘脑总RNA,RT-PCR获得cDNA,以NCBI网站公布的比格犬ERβ基因CDS序列设计特异性引物,扩增ERβ保守区基因编码序列(16-496 bp),连接原核表达载体pMAL-p5x,筛选、鉴定阳性克隆并测序.将重组质粒转化至大肠杆菌DH5α,再转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达,表达产物经经麦芽糖亲和树脂(Amylom Resin)亲和层析分离纯化,并对纯化的融合蛋白进行鉴定.结果 构建了pMAL-p5x/ER(a)480重组质粒,在DE3大肠杆菌中诱导表达出MBP-ERβ融合蛋白,SDS-PAGE显示分子量约为60 000,与预期结果一致;优化了MBP-ERβ表达体系的表达条件:分别在0.2％葡萄糖,100 μg/ml Ampcillin,0.1mmol/L IPTG 37℃培养5h或在0.2％葡萄糖,50 μg/ml Ampcillin,0.2mmol/L IPTG 37℃培养3h,融合蛋白表达效果比较好.结论 构建了pMAL-p5x/ERβ480原核表达重组质粒,获得了比格犬MBP-ERβ融合蛋白,为犬种属特异性ERβ多克隆抗体的制备及功能分析奠定了基础.     

利用荧光mRNA差异显示技术克隆短芒大麦盐胁迫相关基因的ESTs

目的:获取短芒大麦盐胁迫相关基因的ESTs.方法:应用荧光mRNA差异显示技术进行筛选,并利用反向Northern杂交方法对差异片段进行快速鉴定以排除假阳性.结果:共获得32个与盐胁迫相关的cDNA序列,并获得GenBank 注册号.BLAST同源性分析结果表明,13个与已知基因序列有同源性,19个为未知ESTs.其类型分别为:诱导表达型,22个;增强表达型,7个;抑制表达型,3个.结论:通过荧光mRNA差异显示技术获得了短芒大麦盐胁迫相关基因的ESTs,对它们的进一步研究将为短芒大麦耐盐分子机制的发现提供思路.     

基于CRISPR/Cas9技术构建严重联合免疫缺陷小鼠

目的 应用CRISPR/Cas9技术靶向敲除编码小鼠T、B细胞的Rag2基因及编码NK细胞的IL2rg基因,构建T、B细胞及NK细胞联合免疫缺陷小鼠。方法 根据Genbank报道的Rag2及IL2rg基因序列,分别针对其外显子设计25 bp左右的sgRNA并进行合成, sgRNA退火后克隆入pX330载体。Rag2-sgRNA、IL2rg-sgRNA及Cas9重组质粒体外转录为mRNA后显微注射入BALB/c小鼠受精卵细胞,受精卵细胞移植到受体动物获得子代小鼠,首建鼠（F0）与野生型小鼠交配获得F1代小鼠,突变的F1代小鼠互交后筛选F2代纯合子小鼠。通过基因测序、流式细胞技术及接种人源性肿瘤细胞系方法检测子代小鼠基因型和表型。结果 成功构建了Rag2-sgRNA、IL2rg-sgRNA重组质粒并对其进行了体外转录,mRNA显微注射并移植后获得57只F0小鼠。连续交配后,获得F2代纯合子小鼠。序列分析表明子代小鼠中IL2rg有两个基因型,分别是10 bp和11 bp的缺失突变;而Rag2只有一个基因型,为8 bp的缺失突变。与野生型BALB/c小鼠相比,小鼠外周血中CD3、B220及NKp46阳性细胞数量明显降低。接种人乳腺癌细胞系SKBR-2HL后,肿瘤生长良好,且随着时间延长肿瘤组织逐渐增大。结论 利用CRISPR/Cas9技术可有效实现BABL/c小鼠体内Rag2、IL2rg基因突变,并导致小鼠T、B及NK细胞功能异常。     

比格犬雌激素受体β四个剪接异构体的发现

目的在比格犬下丘脑-垂体-性腺轴上筛查雌激素受体13的剪接异构体。方法针对ERβmRNACDS序列的八个外显子,两两外显子依次组合设计引物,运用PCR法,以比格犬下丘脑、垂体、卵巢、子宫组织cDNA为模板扩增相应序列,测序后在NCBI网站比对,确定是目的基因后,用DNAMAN软件比对分析及手工校对,获得ERβ的剪接异构体。结果获得到了比格犬ERβ的四个剪接异构体,分别是第4外显子完整缺失的ERβ剪接异构体（缺失300bp）,部分第4与部分第5外显子组合缺失的两个组合型缺失的ERβ剪接异构体（各缺失334bp,265bp）,以及第七外显子完整缺失的ERβ剪接异构体（缺失181bp）。第4外显子完整缺失的剪接异构体和第7外显子完整缺失的剪接异构体获得了全长编码序列,另两个剪接异构体为部分编码序列。结论研究获得了比格犬ERβ的四个剪接异构体,为后续研究其在比格犬生殖调控中的作用机制打下了基础。     

实验动物致敏研究进展

实验动物致敏(laboratory Animal Allergy, LAA),是一种职业过敏性疾病,造成人的呼吸道及皮肤发生炎症.该病在国外研究较多,过敏源是动物皮毛、尿液、唾液中的一类酸性小分子蛋白质;可以通过皮肤试验、放射过敏吸附试验及ELISA等方法 检测易感人员.对易感人员可以通过控制环境中的过敏原来保护.目前国内尚无专门机构研究此病症,笔者综述了该职业性疾病的症状、机理、控制方法 及国内外对该病症认识上的差异.     

D-gal致大鼠急性肝损伤过程中肝卵圆细胞增殖及迁延

目的用D-gal建立大鼠急性肝损伤模型,观察肝损伤后再生过程中肝卵圆细胞的增殖和迁延。方法建立大鼠急性肝损伤模型,于第1、3、7和14天分别取肝组织,分别行病理、免疫组织化学,观察卵圆细胞的分布迁移情况,并取第7天肝组织进行组织电镜观察汇管区新增生细胞超微结构。结果病理切片显示肝细胞变性坏死程度以第7天和第14天为主,出现新增生的细胞。免疫组化示随时间阳性细胞明显增多,分布于汇管区,并向小叶中心迁移,形成大量的胆小管,并有部分向坏死区迁移。透射电镜有新生内源性细胞,小于成熟的肝细胞,细胞器较少,有细胞紧密连接,以数个细胞排列成小胆管,与免疫组化一致。结论在大鼠急性肝损伤时HOC被活化、增殖,并向肝小叶中心迁移,全程参与了肝再生过程。     

猴B病毒囊膜蛋白gB特异性抗原表位的筛选与表达鉴定

目的筛选和鉴定猴B病毒囊膜蛋白gB的特异性抗原表位,将其应用于B病毒的检测。方法利用蛋白序列比较和表位预测技术筛选猴B病毒囊膜蛋白gB的特异性抗原表位,经PCR扩增后原核表达,纯化,Western-blot鉴定融合蛋白,建立特异性表位的ELISA检测方法 ,并对其效果进行评估。结果琼脂糖凝胶电泳和测序结果显示出目的表位基因完全正确,并且重组蛋白经过SDS-PAGE、Western-blot鉴定,其相对分子质量约为27×103,与预期值相符。筛选出的gB-26肽表位检测结果与文献相符,特异性较好,敏感性稍低。结论建立了猴B病毒囊膜蛋白gB特异性抗原表位筛选和鉴定的实验方法 ,为进一步研制猴B病毒快速诊断试剂盒和猴B病毒亚单位疫苗奠定了基础。     

注射针头十字交叉固定法行猕猴直肠脱截除手术

目的探讨猕猴直肠脱治疗方法,为猕猴常见外科病的治疗提供参考。方法以普通注射针头十字交叉固定法,对8例病例作直肠脱截除手术。结果仅有一例因原发重症肠炎死亡外,其余均获得治愈。结论本法取材方便,固定确实可靠,容易操作。为猕猴养殖企业提供了一种简单易行的治疗手段。     

恒河猴五日热巴尔通体的分离和柠檬酸合成酶基因的序列分析

目的初步研究巴尔通体在恒河猴体内的存在情况,并分析其柠檬酸合成酶(gltA)的基因序列,判断巴尔通体的种属。方法16只来自福建的恒河猴,用血琼脂培养基分离可能存在的巴尔通体。根据NCBI数据库上的巴尔通体gltA的基因序列,设计一对引物,以巴尔通体菌落为模板进行扩增,将获得的序列进行克隆测序。结果从3只恒河猴体内成功分离到了巴尔通体病原,并获得了巴尔通体gltA全长基因序列,测序结果表明该序列与五日热巴尔通体同源性99%。结论福建来源的恒河猴种群携带巴尔通体病原,巴尔通体流行地区可能存在鼠与灵长类动物之间病原体的流行和传播。