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目的:探讨人端粒酶催化亚单位(hTERT)基因核心启动子和原核增强子CMV联合调控单纯疱疹病毒胸苷激酶基因/更昔洛韦系统对TK基因的活性改变及与鼻咽癌细胞中端粒酶活性的关系。方法:将改良构建后的增强型载体pGL3-basic-EGFP-TK-hTRETp-CMV enhancer及单启动子载体pGL3-basic-EGFP-TK-hTRETp(作为对照组)分别转染端粒酶阳性的人鼻咽癌5-8F细胞株及对照组细胞人乳腺癌MCF-7细胞(端粒酶阳性)及正常人血管内皮ECV细胞(端粒酶阴性),采用荧光显微镜下观察其TK基因绿色荧光蛋白表达,实时荧光定量PCR方法检测转染细胞中TK基因mRNA定量表达差异,TRAP银染法检测肿瘤细胞转染前后端粒酶活性改变并分析TK基因表达与端粒酶活性之间的关系。结果:①增强型表达载体转染鼻咽癌5-8F细胞及乳腺癌MCF-7细胞均有很强的荧光表达及TK基因的mRNA表达,比单启动子pGL3-basic-EGFP-TK-hTRETp及ECV细胞绿色荧光要强。实时荧光定量PCR显示,增强型载体组A值亦较对照组明显增高。②转染增强型载体(加GCV)后TRAP银染法检测鼻咽癌5-8F细胞端粒酶活... 相似文献
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目的探讨缺氧及siRNA沉默缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)后对鼻咽癌细胞中端粒酶催化亚单位(telomerase catalytic subunit,hTERT)、细胞周期和化疗耐药的影响。方法采用三气培养箱对鼻咽癌细胞5-8F和CNE2进行缺氧处理(1%O2),蛋白质印迹法检测不同乏氧时相(0~72h)HIF-1α和hTERT蛋白的表达。将HIF-1α基因特异性siRNA分别转染鼻咽癌细胞株5-8F和CNE2,筛选出沉默效率最高的siRNA,实验分为未处理组(常氧)、未处理组(缺氧)、Negative-siRNA(缺氧)和HIF-1α-siRNA(缺氧),荧光定量PCR及蛋白质印迹检测瞬时转染后hTERT及HIF-1α的表达。流式细胞术(flow cytometry,FCM)分析缺氧或沉默HIF-1α后对细胞周期的影响。MTT法检测缺氧或沉默HIF-1α后,鼻咽癌细胞对顺铂(DDP)和5-氟尿嘧啶(5-FU)的化疗敏感性。结果缺氧处理0~72h后鼻咽癌5-8F细胞HIF-1α(F=37.147,P<0.001)和hTERT(F=70.069,P<0.001)蛋白的表达上调,差异有统计学意义。HIF-1α-siRNA对5-8F细胞瞬时转染率>98%。HIF-1α-siRNA组hTERT mRNA表达量为0.37±0.05,显著低于未处理组(缺氧)的1.00±0.00和Negative-siRNA(缺氧)的0.95±0.01,F=360.339,P<0.001;hTERT蛋白表达量为(0.27±0.05),显著低于未处理组(缺氧)0.54±0.00和Negative-siRNA组(缺氧)0.53±0.01,F=24.010,P<0.001。未处理组(缺氧)G0/G1期细胞比例明显增加(45.63±2.01)%,显著高于未处理组(常氧)的(26.75±1.28)%,P<0.001。5-8F细胞未处理组(常氧)对5-FU的IC50分别为(17.30±3.31)μg/mL,未处理组(缺氧)为(32.04±12.75)μg/mL,Negative-siRNA组为(33.90±0.87)μg/mL,HIF-1α-siRNA组为(13.72±2.36)μg/mL,F=3.704,P<0.001。5-8F细胞缺氧组对DDP的化疗敏感性也降低,沉默HIF-1α后,5-8F细胞对DDP的化疗敏感性明显提高。除细胞周期外,CNE2与5-8F的结果均一致。结论缺氧促使鼻咽癌细胞发生G1/S阻滞及化疗耐药,可能与上调hTERT表达,进而上调端粒酶活性有关;沉默HIF-1α显著逆转缺氧诱导的肿瘤耐药并下调端粒酶活性。 相似文献
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