人鼻咽癌细胞株中类肿瘤干细胞的分离、培养及鉴定

目的检测CD133在人鼻咽癌细胞株SUNE中的表达以及CD133^＋肿瘤细胞的体外增殖、分化情况,并对其进行类肿瘤干细胞的鉴定。方法采用免疫荧光细胞化学技术及流式细胞仪检测鼻咽癌细胞株SUNE中CD133的表达情况以及CD133^＋细胞体外分化能力；免疫磁珠分选技术纯化CD133^＋肿瘤细胞；MTT法检测CD133^＋细胞的体外增殖能力,并将其与CD133^-及未分选细胞进行比较。结果鼻咽癌细胞株SUNE中有0.35%的微量细胞呈CD133^＋表达；免疫磁珠富集的CD133^＋肿瘤细胞在无血清培养基中悬浮生长,并可以形成肿瘤细胞球,具有很强的自我更新和繁殖能力,且在3、5、7 d的紫外吸光度（A）值分别为0.317±0.007、0.370±0.002、0.558±0.004,均高于相同条件下未分选细胞和CD133^-细胞（P〈0.05）；CD133^＋细胞在含血清培养基中的比例逐日下降,至培养的第12天,由第1天的89.67%下降至0.37%。结论CD133可作为鼻咽癌类干细胞的标志之一。鼻咽癌细胞株SUNE中存在类肿瘤干细胞,并具有自我更新和分化能力。     

耳鼻咽喉-头颈外科学课程解剖生理双语教学模式初探

本文探讨了耳鼻咽喉-头颈外科学课程中解剖生理双语教学的模式、实施效果、优势及存在问题.教学实践表明,耳鼻咽喉-头颈外科学课程中解剖生理开展双语教学是可行的.为了提高教学效果,双语教学应当特别关注教学质量、提高学生学习主动性、提高师资外语水平及建立完善的双语教学评价体系等方面的问题.

Abstract：

Bilingual teaching model and its effect, advantages and possible problems for the anatomy and physiology of otorhinolaryngology were explored in this article. It showed that bilingual teaching was feasible for teaching anatomy and physiology of otorhinolaryngology. In order to improve the teaching effect,special attentions must be paid to the teaching quality,the elevation of students' activity,the improvement of teachers' English level and the establishment of teaching evaluation system in bilingual teaching.     

鼻内镜口腔途径选择性切除儿童肥大腺样体的手术技巧及疗效分析

目的 探讨鼻内镜下经口腔电动吸切选择性切除儿童肥大腺样体手术方式及疗效分析.方法 对有多种典型临床症状(包括打鼾、鼻塞、流脓涕、听力下降、口颌面部及生长发育畸形等)的56例腺样体肥大患儿,全麻下开口器撑开口腔并拉起软腭,经口腔插入70°鼻内镜显露鼻咽部肥大的腺样体,采用弯头正反向切割吸引刀头,明视下选择性吸切阻挡后鼻孔区的肥大腺样体部分,其余腺体组织保留,并与传统的盲刮法(79例)及鼻内镜下全切除法(25例)进行疗效比较.结果 本组全部患儿术后1～3天打鼾症状基本消失,未见术后并发症.手术创伤轻,出血少,患儿恢复快,经随访1～6个月,鼻部阻塞症状消失及明显改善49例(占87.5％),13例有耳部症状者治愈及明显好转者9例(占69.2％).而对照组盲刮法鼻症状改善有效率(62％),术后反应较重,出血较多;全切法有效率(84％),出血较多,术后反应较重.结论 采用鼻内镜经口明视下选择性吸切阻挡后鼻孔区的肥大腺样体部分,具有手术在明视下操作,术腔较宽敞、安全有效、微创、出血少及术后恢复快等优点,在众多的手术方法中是一种较为理想的选择术式.     

增强型胸苷激酶基因表达载体的构建及其杀伤鼻咽癌细胞的实验研究

目的 探讨改良构建人端粒酶催化亚单位(human telomerase catalytic subunit promoter,hTERT)启动子及巨细胞病毒原核(cytomegalovirus,CMV)增强子联合调控单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(thymidine kinase,TK)的增强型表达载体在鼻咽癌细胞体内外实验中的靶向杀伤效应及体内应用的安全性评价.方法 以pGL3-basic空载体为模板,分别酶切连接hTERT启动子、CMV增强子及TK基因构建靶向性增强型表达载体pGL3-basic-EGFP-TK-hTERTp-CMV(以hTERT单启动子调控TK基因表达载体作为对照组),转染端粒酶阳性的人鼻咽癌5-8F细胞及用做对照组的人乳腺癌MCF-7细胞和端粒酶阴性的正常人脐静脉内皮细胞ECV-304,分别采用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达差异、实时荧光定量PCR检测转染后TK基因mRNA表达差异、TeloChaser法检测上述细胞中的端粒酶活性、四甲基偶氮唑蓝(MTt)联合Boyden小室实验分析增强型载体对鼻咽癌细胞增殖及侵袭抑制的作用.将鼻咽癌细胞接种于裸鼠腋部皮下,构建裸鼠鼻咽癌移植瘤模型,研究增强型载体对裸鼠移植瘤的体内生长抑制作用及对全身的毒副反应情况.结果 ①成功改良构建hTERT/CMV双调控TK基因的增强型表达载体.②转染增强型载体组及单启动子载体组的鼻咽癌5-8F细胞均有绿色荧光表达,但前者荧光数量及强度均较后者强,对照组端粒酶阳性的乳腺癌细胞也有很强的荧光表达,而ECV-304细胞几乎无绿色荧光表达.实时荧光定量PCR结果显示,增强型载体组的TK基因mRNA表达量是单启动子组的2-5倍.③ TeloChaser法结果显示,两种肿瘤细胞(5-8F细胞、MCF-7细胞)端粒酶活性均为阳性,正常对照ECV-304细胞端粒酶活性为阴性.④MTT联合Boyden小室侵袭实验结果显示,增强型表达载体对5-8F细胞体外增殖及侵袭力均有明显抑制作用.相对细胞存活率为37.0%,较对照组明显低(P<0.01).⑤体内实验结果显示,增强型靶向表达载体对裸鼠鼻咽癌移植瘤生长具有明显抑制作用,抑瘤率达56.3%,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01),而裸鼠肝肾病理检查未发现明显损害.结论 以hTERT/CMV双调控机制介导TK基因的增强型表达载体能够高效、靶向杀伤鼻咽癌细胞及移植瘤,实验动物体内应用无明显毒副作用.     

间充质干细胞靶向转运胸苷激酶基因联合更昔洛韦杀伤鼻咽癌细胞*

背景：研究证实,间充质干细胞能通过基因修饰成为肿瘤治疗的靶向载体。 目的：观察转染胸苷激酶基因的胸苷激酶-间充质干细胞联合更昔洛韦对鼻咽癌细胞的靶向杀伤作用。 方法：应用LipofectamineTM 2000将表达胸苷激酶基因的重组质粒pGL3-EGFP-胸苷激酶转染至SD大鼠间充质干细胞,观察其增殖能力。应用Transwell小室观察胸苷激酶-间充质干细胞的归巢特性;将胸苷激酶-间充质干细胞植入裸鼠,观察其致瘤性;用胸苷激酶-间充质干细胞/更昔洛韦干预人鼻咽癌细胞5-8F,观察其对细胞的杀伤作用及旁观者效应。 结果与结论：荧光显微镜观察及RT-PCR检测结果提示实验成功将胸苷激酶基因转染至间充质干细胞,CCK-8检测结果显示胸苷激酶-间充质干细胞与间充质干细胞增殖能力差异无显著性意义(P > 0.05)。Transwell小室迁移实验显示胸苷激酶-间充质干细胞具有归巢特性,裸鼠移植瘤实验显示胸苷激酶-间充质干细胞无致瘤性。CCK-8检测检测发现胸苷激酶-间充质干细胞/更昔洛韦具有旁观者效应,可明显降低5-8F的生存率(P < 0.01)。提示胸苷激酶-间充质干细胞/更昔洛韦对鼻咽癌细胞具有靶向迁移及杀伤作用,间充质干细胞可作为治疗鼻咽癌的理想靶向转运载体。 关键词：鼻咽肿瘤;间充质干细胞;基因治疗;归巢;旁观者效应 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.10.026     

hTERT启动子调控TK基因靶向性杀伤鼻咽癌移植瘤的实验研究

目的 研究人端粒酶反转录酶(hTERT)基因核心启动子调控的单纯疱疹病毒胸苷激酶基因/更昔洛韦(HSV-TK/GCV)系统对鼻咽癌移植瘤的体内杀伤作用. 方法 采用培养细胞移植法,将人鼻咽癌细胞系C666-1接种于裸鼠腋部皮下,建立裸鼠人鼻咽癌移植瘤模型.将40只裸鼠随机分为5组:hTERTp/HSV-TK/PGL3/GCV组、CMV/HSV-TK/PGL3/GCV组、HSV-TK/PGL3/GCV组、GCV组及生理盐水组,每组8只.采用脂质体介导,进行瘤内直接注射,同时经腹腔给予GCV治疗,观察各组裸鼠生存状况及肿瘤相对体积、抑瘤率,并进行荷瘤裸鼠肝肾组织的常规病理检查. 结果 成功构建了 C666-1裸鼠皮下移植瘤动物模型,hTERTp/HSV-TK/PGL3/GCV组移植瘤被明显抑制,抑瘤率达到45.51%,与HSV-TK/PGL3/GCV组、GCV组及生理盐水组(抑瘤率分别为5.52%、14.31%、0.03%)比较有显著性差异(P＜0.01),肝肾病理检查发现,该组裸鼠肝肾均无明显病理学变化.CMV/HSV-TK/PGL3/GCV组的抑瘤率亦达到51.56%,但病理检查发现裸鼠出现肝肾毒性. 结论 hTERT启动子调控TK基因靶向治疗系统能够在体内特异性杀伤鼻咽癌移植瘤,而无明显全身毒副作用,是一种安全、有效的肿瘤靶向基因治疗系统,将为鼻咽癌临床基因治疗开辟新领域.     

hTERT及CMV双调控TK基因靶向杀灭鼻咽癌细胞的实验研究

目的 探讨hTERT启动子及CMV增强子双调控表达载体调控TK基因靶向杀灭鼻咽癌细胞的效应.方法 将双调控增强型载体及hTERT单启动子载体(作为对照组)分别转染两种端粒酶(+)的人鼻咽癌5-8F细胞及对照组人乳腺癌MCF-7细胞及端粒酶(-)的正常人血管内皮ECV细胞,Stretch PCR法验证5-8F细胞、MCF-7细胞及ECV细胞中端粒酶活性,荧光显微镜下观察TK基因绿色荧光蛋白表达差异,MTT法分析杀灭鼻咽癌细胞的效果.结果 ①Stretch PCR法验证人鼻咽癌细胞5-8F、人乳腺癌细胞MCF-7端粒酶活性星阳性,人血管内皮ECV细胞端粒酶活性呈阴性.②增强型表达栽体转染上述两种端粒酶(+)肿瘤细胞均有很强的荧光表达及TK基因的mRNA表达,单启动子亦有较强的荧光表达,但比增强型表达载体要弱,而ECV细胞几乎无绿色荧光.③加入GCV后,增强型表达载体对两种端粒酶(+)肿瘤细胞体外增殖均有明显抑制作用,且均高于单启动子组、空载体组及空白对照组,而增强型表达载体转染ECV细胞体外增殖无明显抑制作用.结论 以hTERT启动子及CMV增强子双调控TK基因的表达载体能够靶向杀灭鼻咽癌细胞,且作用明显强于单启动子载体组.这种新型高效、靶向增强型载体有可能成为一种鼻咽癌临床靶向基因治疗的新策略.     

Nods样模式识别受体在鼻息肉组织中的表达及意义

目的：探讨Nods（核苷酸结合寡聚化结构域,Nod Like receptors）样模式识别受体（PRR）在鼻息肉组织中的表达及作用。方法：分别采用实时定量RT—PCR、Western—Blot及免疫组织化学检测Nodl、Nod2、Nalp3mRNA及蛋白在鼻息肉组织中的表达（以正常下鼻甲黏膜作对照）。结果：实时定量RT—PCR显示,鼻息肉组织Nodl、Nod2、Nalp3mRNA表达与正常对照下鼻甲黏膜比较无显著差异。Western-Blot结果提示：鼻息肉组织Nodl表达高于对照组,两组Nod2、Nalp3无明显差异。免疫组织化学表明,三种模式受体在两组中均有表达,主要表达于上皮细胞、腺体上皮、炎性细胞（如嗜酸粒细胞）,但Nodl及Nalp3在鼻息肉中表达强于对照组（P〈0．05）,Nod2蛋白表达无显著差异。结论：在鼻息肉组织中,Nodl、Nod2及Nalp3均有表达,其中Nodl、Nalp3的表达高于对照组,说明Nodl、Nalp3有可能参与鼻息肉的发病。     

耳鼻咽喉-头颈外科学课程解剖生理双语教学模式初探

本文探讨了耳鼻咽喉-头颈外科学课程中解剖生理双语教学的模式、实施效果、优势及存在问题.教学实践表明,耳鼻咽喉-头颈外科学课程中解剖生理开展双语教学是可行的.为了提高教学效果,双语教学应当特别关注教学质量、提高学生学习主动性、提高师资外语水平及建立完善的双语教学评价体系等方面的问题.     

人鼻咽癌CD133+干细胞的生物学特性及意义人鼻咽癌CD133+干细胞的生物学特性及意义

背景:有研究表明肿瘤细胞株中存在肿瘤干细胞,是肿瘤复发、转移的根源,但人鼻咽癌细胞株CNE-2中肿瘤干细胞的表达及生物学特性至今少有报道.目的:观察人鼻咽癌CD133+干细胞生物学特性及意义.方法:采用流式细胞仪检测人鼻咽癌细胞株CNE-2中CD133的表达情况.免疫磁珠分选技术获得人鼻咽癌CD133+干细胞,分别采用无血清培养法、CCK-8法、平板克隆形成试验及裸鼠体内成瘤实验检测CD133+干细胞的体外增殖及体内成瘤能力,并将其与CD133-及未分选鼻咽癌细胞进行比较,以了解CD133+干细胞的生物学特性.结果与结论:免疫磁珠富集的CD133+细胞在无血清培养基中呈悬浮生长,并可以形成肿瘤干细胞球.CD133+细胞与CD133-细胞比较具有较高的克隆形成能力(P < 0.01);CD133+细胞在裸鼠体内的成瘤率高于CD133-细胞(P < 0.05).结果证实,鼻咽癌CD133+干细胞能在体外分离培养,形成干细胞球,增殖能力强,在裸鼠体内具有极强的成瘤能力.