应用蛋白质组分析法初步探讨胆囊收缩素在皮质神经元中的信号转导途径

目的:通过应用蛋白质组学的方法与技术,对八肽胆囊收缩素(octapeptite cholecystokinin,CCK8)作用于乳小鼠皮质神经元后蛋白质磷酸化状态进行分析,为初步探讨胆囊收缩素在皮质神经元中的信号转导途径提供依据.方法:培养乳小鼠皮质神经元,掺入32P-NaH2PO4(2.03×105Bq/ml)2h,实验组及对照组分别加入CCK8和无磷培养基进行培养,收集细胞,提取蛋白,蛋白含量测定.双向电泳分离蛋白,放射自显影获得磷酸化蛋白质的电泳图谱.结果:①对蛋白质组分析法中各个环节实行了筛选及优化,得到比较清晰的放射自显影图谱.②由放射自显影图谱可见,与CCK8信号转导相关的磷酸化蛋白质大约有46个,包括了多种蛋白激酶、细胞膜受体、胞内信号分子、转录因子等.结论:蛋白质组学的方法与技术可以行之有效的应用于信号转导途径中蛋白质磷酸化状态的分析.根据神经元蛋白质磷酸化状态分析的结果,可推测CCK8在皮质神经元的信号转导途径可能包括肌醇磷脂信使系统、cAMP-PKA途径、MAPK途径等.     

卵巢癌组织蛋白双向电泳分析技术的建立

目的:初步建立卵巢癌蛋白质组研究的双向凝胶电泳技术,提高其分辨率及重复性.方法:提取卵巢癌肿瘤组织中蛋白质,以固相pH梯度等电聚焦为第一向,对关键环节如样品处理、上样量分析和水化等进行一系列优化.进一步采用垂直SDS-PAGE进行第二相分离,银染显色、图像分析或软件分析电泳图谱.结果:通过实验条件的反复筛选获得了较为满意的卵巢癌双向凝胶电泳图谱.结论:本文初步建立了卵巢癌蛋白质组双向电泳分析方法,具有较好的分辨率和重复性,为进一步研究卵巢癌的差异表达及特异性分子标志物的筛选奠定了基础.     

Stathmin蛋白:一个潜在的肿瘤标志物

人stathmin也称原癌基因蛋白18(oncogene protein 18, Op18), 是一种广泛存在于细胞质的蛋白质,其相对分子质量约为19×10~3,可与微管蛋白结合,参与微管和纺锤体的组装;与细胞的增殖、分化、再生和运动均有关,并具有信号活性调节的功能.近年来有研究发现,stathmin在多种肿瘤中高表达,并可通过调节微管的解聚,促进肿瘤细胞的运动及侵袭.Stathmin翻译后修饰状态的改变,可影响与p53蛋白的相互作用,参与肿瘤的发生发展.目前单独或者联合化疗药物使用的抗stathmin效应剂已用于某些肿瘤的治疗.虽然stathmin与肿瘤病因学的内在联系尚不十分清楚,但其作为一个潜在的肿瘤标志物或药物靶点值得进一步研究探讨.     

原癌基因蛋白18第38位丝氨酸点突变肝癌细胞系的建立

目的构建人原癌基因蛋白18(oncoproteins 18,Op18)丝氨酸(serine,Ser)38磷酸化位点点突变(S38A)的肝癌细胞系。方法通过重叠延伸聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)的方法定点诱变Op18 S38A,测序鉴定突变结果。采用脂质体转染和抗生素筛选,建立Op18野生型(wild types,wt)和Op18S38A的肝癌细胞株HCCLM6;并用Western blot进行鉴定。结果定点突变构建Op18 S38A的重组质粒经测序证实Op18第38位核苷酸突变由丝氨酸变为丙氨酸。将Op18 wt和Op18 S38A转染肝癌细胞株HCCLM6,抗生素压力筛选建立稳定表达的肝癌细胞株,Western blot结果显示Op18第38位丝氨酸磷酸化(pS38)在Op18 S38A细胞中的表达较Op18 wt和对照组细胞明显下降(P<0.05)。结论建立了稳定表达Op18 S38A的肝癌细胞株,为研究Op18位点磷酸化在肝癌发病中的分子机制提供细胞模型。