神经细胞体外分离培养的比较研究

目的：对神经元分离、培养的不同实验方法进行比较研究。方法：取成年小鼠和新生小鼠的脑皮质或全脑组织，经胰蛋白酶消化分离后，分别在普通RPMI-1640培养基、含阿糖胞苷的培养基、含Neurol Medium和B27的培养基3种不同条件下进行培养，观察神经元的生长情况。结果：采用普通RPMI-1640培养基培养的神经元被胶质细胞掩盖，形态不典型，神经元比例小；用含阿糖胞苷的培养基培养的神经元所含比例较高，但形态不太典型；用含Neurol Medium和M27的培养基培养的神经元形态典型，生长良好。结论：采用含Neurol Medium和M27的培养基可以从的乳鼠的全脑组织中培养出形态典型，生长良好，较为纯净的神经元，方法简便，得率高，这为进一步深入探讨其功能奠定了良好基础。     

类法尼醇X受体在巨噬细胞中下调单核细胞趋化蛋白1的表达

目的研究小鼠巨噬细胞株ANA-1中类法尼醇X受体的表达情况,并进一步研究类法尼醇X受体天然配体鹅脱氧胆酸在ANA-1中对单核细胞趋化蛋白1表达的影响,以探讨类法尼醇X受体在动脉粥样硬化发生发展中的作用。方法应用逆转录聚合酶链反应检测类法尼醇X受体在ANA-1细胞中的表达,及鹅脱氧胆酸处理后单核细胞趋化蛋白1的转录水平,Westernblot检测类法尼醇X受体的表达及其激活后对自身蛋白表达的调节,以及单核细胞趋化蛋白1蛋白的表达水平。结果类法尼醇X受体在ANA-1中表达,并依赖鹅脱氧胆酸浓度自我上调,鹅脱氧胆酸能显著下调单核细胞趋化蛋白1的表达水平(P<0.05)。结论类法尼醇X受体在小鼠巨噬细胞株ANA-1中组成型表达并呈配体浓度依赖性自我上调,类法尼醇X受体激活后可通过直接或间接方式下调单核细胞趋化蛋白1的表达。     

神经元蛋白质磷酸化修饰分析方法的初步研究

目的　建立一种对神经细胞中的磷酸化蛋白质进行分离分析的方法。方法　培养新生乳小鼠神经细胞 ,加入 32 P- Na H2 PO4 2 .78× 10 6 Bq/ ml,37℃孵育 1.5 h。刺激组分别加入表皮生长因子 (EGF) 2 0 ng/ m l或胰岛素10 0 nm ol/ L,对照组加入等量的培养基 ,作用不同时间后液氮终止反应。裂解细胞 ,用 Bio- Rad DC Protein Assaykit测定细胞蛋白质含量 ,双向电泳分离细胞蛋白。放射自显影。结果　 1双向电泳自显影图谱显示近数十个蛋白质斑点 ,绝大部分集中于 p H偏酸性和中性区域 ,p H4 .6～ 6 .5 ,其相对分子质量主要介于 2 0× 10 3～ 130× 10 3之间。2 EGF、胰岛素刺激不同时间后虽出现有磷酸化蛋白质斑点的增加或消失 ,但更多表现为某些磷酸化蛋白质斑点灰度的增强或减弱。 3对比分析发现 ,放射自显影图谱中只有少数斑点出现在双向电泳 Coom assie Brilliant BlueR- 2 5 0染色图谱中 ,提示神经细胞中的大多数磷酸化蛋白质为低丰度蛋白。结论　采用本研究建立的双向电泳和放射自显影技术可对神经细胞中的蛋白质可逆磷酸化修饰状态进行较为全面、动态的分析 ,方法灵敏、特异性强 ,可为细胞信息传递功能蛋白质组的研究奠定了基础     

古抑菌素A对肝癌细胞HepG2中抑癌基因FHIT表达的影响

目的：探讨去乙酰化转移酶抑制剂古抑菌素A（trichostatin A,TSA）对人肝癌HepG2细胞生长的作用以及FHIT表达的影响。方法：体外培养人肝癌细胞株HepG2,分为对照组和不同浓度（5、50、250、500、1000nmol/L）TSA组,作用24h和48h后在倒置显微镜下观察细胞形态改变,CCK-8法检测TSA对HepG2细胞增殖的影响,实时荧光定量RT-PCR法检测FHIT基因的表达。结果：倒置显微镜下,经TSA处理的细胞增殖速度显著减慢,出现凋亡早期改变,与对照组相比,TSA可明显抑制HepG2的增殖,且呈时效和剂量依赖关系（P〈0.01）,荧光定量PCR结果显示TSA可以使FHIT表达上调（P〈0.01）。结论：TSA对肝癌HepG2细胞体外生长有明显抑制作用,可能与促进FHIT表达有一定关系。     

蛋白质组学技术与肿瘤研究

蛋白质组学作为后基因组研究的一个重要组成部分 ,借助蛋白质组学研究技术 ,可在蛋白质水平进一步揭示肿瘤的发病机制 ,筛选、鉴定肿瘤特异性标记和特异性抗原以及有效的药物靶蛋白。     

原癌基因蛋白18第38位丝氨酸点突变肝癌细胞系的建立

目的构建人原癌基因蛋白18(oncoproteins 18,Op18)丝氨酸(serine,Ser)38磷酸化位点点突变(S38A)的肝癌细胞系。方法通过重叠延伸聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)的方法定点诱变Op18 S38A,测序鉴定突变结果。采用脂质体转染和抗生素筛选,建立Op18野生型(wild types,wt)和Op18S38A的肝癌细胞株HCCLM6;并用Western blot进行鉴定。结果定点突变构建Op18 S38A的重组质粒经测序证实Op18第38位核苷酸突变由丝氨酸变为丙氨酸。将Op18 wt和Op18 S38A转染肝癌细胞株HCCLM6,抗生素压力筛选建立稳定表达的肝癌细胞株,Western blot结果显示Op18第38位丝氨酸磷酸化(pS38)在Op18 S38A细胞中的表达较Op18 wt和对照组细胞明显下降(P<0.05)。结论建立了稳定表达Op18 S38A的肝癌细胞株,为研究Op18位点磷酸化在肝癌发病中的分子机制提供细胞模型。     

应用蛋白质组分析法初步探讨胆囊收缩素在皮质神经元中的信号转导途径

目的:通过应用蛋白质组学的方法与技术,对八肽胆囊收缩素(octapeptite cholecystokinin,CCK8)作用于乳小鼠皮质神经元后蛋白质磷酸化状态进行分析,为初步探讨胆囊收缩素在皮质神经元中的信号转导途径提供依据.方法:培养乳小鼠皮质神经元,掺入32P-NaH2PO4(2.03×105Bq/ml)2h,实验组及对照组分别加入CCK8和无磷培养基进行培养,收集细胞,提取蛋白,蛋白含量测定.双向电泳分离蛋白,放射自显影获得磷酸化蛋白质的电泳图谱.结果:①对蛋白质组分析法中各个环节实行了筛选及优化,得到比较清晰的放射自显影图谱.②由放射自显影图谱可见,与CCK8信号转导相关的磷酸化蛋白质大约有46个,包括了多种蛋白激酶、细胞膜受体、胞内信号分子、转录因子等.结论:蛋白质组学的方法与技术可以行之有效的应用于信号转导途径中蛋白质磷酸化状态的分析.根据神经元蛋白质磷酸化状态分析的结果,可推测CCK8在皮质神经元的信号转导途径可能包括肌醇磷脂信使系统、cAMP-PKA途径、MAPK途径等.     

卵巢癌组织蛋白双向电泳分析技术的建立

目的:初步建立卵巢癌蛋白质组研究的双向凝胶电泳技术,提高其分辨率及重复性.方法:提取卵巢癌肿瘤组织中蛋白质,以固相pH梯度等电聚焦为第一向,对关键环节如样品处理、上样量分析和水化等进行一系列优化.进一步采用垂直SDS-PAGE进行第二相分离,银染显色、图像分析或软件分析电泳图谱.结果:通过实验条件的反复筛选获得了较为满意的卵巢癌双向凝胶电泳图谱.结论:本文初步建立了卵巢癌蛋白质组双向电泳分析方法,具有较好的分辨率和重复性,为进一步研究卵巢癌的差异表达及特异性分子标志物的筛选奠定了基础.     

Stathmin蛋白:一个潜在的肿瘤标志物

人stathmin也称原癌基因蛋白18(oncogene protein 18, Op18), 是一种广泛存在于细胞质的蛋白质,其相对分子质量约为19×10~3,可与微管蛋白结合,参与微管和纺锤体的组装;与细胞的增殖、分化、再生和运动均有关,并具有信号活性调节的功能.近年来有研究发现,stathmin在多种肿瘤中高表达,并可通过调节微管的解聚,促进肿瘤细胞的运动及侵袭.Stathmin翻译后修饰状态的改变,可影响与p53蛋白的相互作用,参与肿瘤的发生发展.目前单独或者联合化疗药物使用的抗stathmin效应剂已用于某些肿瘤的治疗.虽然stathmin与肿瘤病因学的内在联系尚不十分清楚,但其作为一个潜在的肿瘤标志物或药物靶点值得进一步研究探讨.