早期肠道营养对烧伤大鼠肠粘膜损伤和修复的影响

目的研究早期肠道营养对烧伤大鼠肠粘膜损伤和修复的影响及其可能的机制.方法采用30%体表面积Ⅲ度烧伤大鼠模型,随机分成伤前对照(C),静脉营养(PN)及肠道营养(EN)组,EN和PN组给予等氮、等热卡、等体积的营养液.在此基础上动态观察了肠组织中肠三叶因子(ITF)含量、血浆二氨氧化酶(DAO)活性、肠粘膜跨膜电位差(PD)及增殖细胞核抗原(PCNA)的变化,并进行相关分析.结果烧伤后肠粘膜组织结构受损,血浆DAO活性明显增高,从伤前的0.32±0.02(103U·L-1)增为1.23±0.53(103U·L-1),相差显著(P＜0.01).而PD,PCNA值及ITF含量分别从伤前的13.53±0.41(mV),823.46±240.56(A),369±65(ng·g-1)降至伤后的5.27±0.17(mV),247.39±112.23(A)和15±4(ng·g-1),相差显著(P＜0.05～0.01).两组相比EN组大鼠肠道受损程度明显低于PN组,同时其ITF含量、PD,PCNA值均高于PN组[EN组分别为129±46(ng·g-1),6.02±0.17(mV)和612.66±188.27(A)而PN组分别为15±4(ng·g-1),5.27±0.17(mV)和247.39±112.23(A)];而EN组大鼠血浆DAO活性为0.61±0.14(103U·L-1)显著低于PN组的0.90±0.16(103U·L-1)(P＜0.01).相关分析显示,ITF含量同血浆DAO活性呈显著负相关(r1=-0.964,P＜0.01),而同PCNA及PD值呈显著正相关(r2=0.884,P＜0.05;r3=0.983,P＜0.01).结论严重烧伤后肠粘膜结构受损与肠道合成和分泌ITF的能力大幅下降有关,肠道营养可降低伤后ITF下降的幅度可能是其在减轻肠粘膜损伤,促进肠粘膜修复方面优于静脉营养的重要原因.     

热休克蛋白70对肠上皮细胞缺氧/复氧后线粒体功能及能量代谢的影响

目的 了解Ad-热休克蛋白70(HSP70)对缺氧/复氧损伤后肠上皮细胞线粒体功能及能量代谢的影响.方法 取肠上皮细胞株IEC-6分别转染Ad-HSP70腺病毒载体和空腺病毒载体,蛋白质印迹法观察HSP70的表达.取IEC-6细胞分为正常对照组(不作任何处理)、缺氧/复氧组(给予缺氧/复氧处理)、Ad-HSP70转染组(转染Ad-HSP70腺病毒载体后,给予缺氧/复氧处理).采用噻唑蓝比色法检测细胞内线粒体脱氧酶的活性,高效液相色谱分析法测定细胞能量代谢.结果 与转染空腺病毒载体相比,转染Ad-HSP70腺病毒载体可显著增加细胞HSP70的表达.缺氧/复氧组细胞内线粒体脱氢酶的活性明显低于正常对照组(P＜0.01),Ad-HSP70转染组该指标明显高于缺氧/复氧组(P＜0.01).缺氧/复氧组细胞内腺苷三磷酸含量较正常对照组显著下降,而腺苷二磷酸、腺苷-磷酸含量显著升高;Ad-HSP70转染组细胞能量指标与正常对照组相似(P＞0.05),较缺氧/复氧组有明显改善(P＜0.05或P＜0.01).缺氧/复氧组细胞能荷为0.615±0.060,明显低于正常对照组(0.748±0.012,P＜0.01)、Ad-HSP70转染组(0.736±0.028,P＜0.01).结论 Ad-HSP70腺病毒载体转染肠上皮细胞可诱导HSP70表达增加,显著提高细胞缺氧/复氧后胞内腺苷三磷酸的含量及细胞能荷,保护线粒体整体功能,提示线粒体是HSP70保护肠上皮细胞缺氧/复氧损伤的主要靶细胞器之一.     

烧伤后肠黏膜细胞外基质与细胞凋亡关系的实验研究

目的　探讨烧伤后大鼠肠黏膜细胞凋亡与细胞外基质的关系。　方法　 30只Wistar大鼠随机分为烧伤后 6、12h,1、3、5d组及正常对照组 ,每组 5只。检测肠黏膜上皮细胞凋亡数、cas pases 3酶活性、细胞外基质成分 (层粘连蛋白、Ⅳ型胶原 )含量 ,并作相关分析。　 结果　烧伤后大鼠肠上皮凋亡细胞数、caspases 3的活性较正常对照组明显升高 (P <0.0 5或 0 .0 1) ,大鼠肠黏膜层粘连蛋白、Ⅳ型胶原含量较正常对照组下降 ( P <0.0 5或 0 .0 1)。直线相关分析结果 :烧伤后肠黏膜层粘连蛋白、Ⅳ型胶原含量变化与细胞凋亡数呈显著的负相关 (r =- 0.5 75, - 0.6 13,P <0 0 5 )。　 结论　烧伤后大鼠肠黏膜细胞凋亡增加 ,且与细胞外基质的变化相关。     

高效稳定表达人缺氧诱导因子抑制因子肠上皮细胞株的建立

目的通过转染含有人FIH全长cDNA的质粒pcDNA3．1-V5．His-A-FIH，建立FIH高效表达的肠上皮细胞株。方法对pcDNA3．1-V5-His-A-FIH进行扩增、提取，用脂质体Lipofectamine 2000将pcDNA3．1-V5-His-A-FIH转入Caco-2细胞，经G418筛选并逐步传代，RT-PCR和Western blot法检测阳性细胞克隆FIH mRNA和蛋白表达。结果转染pcDNA3．1-V5-His-A-FIH后Caco-2细胞FIH mRNA是普通Caco-2细胞的1．98倍，而FIH蛋白含量是普通Caco-2细胞的1.70倍。结论成功建立了高效、稳定表达人FIH基因的肠上皮细胞株。     

谷氨酰胺强化的肠内营养对烧伤后肠源性高代谢的影响

目的:探讨谷氨酰胺强化的肠内营养对烧伤后肠源性高代谢的影响及机制。方法:将88只Wistar大鼠随机分为烧伤后常规肠内营养支持组(B)和谷氨酰胺(Gln)强化的肠内营养组,并与烧伤前指标作对照(PBD0)。烧伤大鼠均经占体表面积30%的全层皮肤烧伤,B组和Gln组采用等氮、等热卡的营养支持,Gln组予1.0g/(kg·d)的Gln,B组予等量的甘氨酸。观察烧伤前和烧伤后(PBD)1、3、5、7、10d大鼠静息能量代谢率(REE)的变化,同时检测了血浆Gln浓度、二胺氧化酶(DAO)活性、内毒素(LPS)、肿瘤坏死因子(TNF)和白细胞介素-1(IL-1)含量,并进行比较分析。结果:烧伤后两组大鼠血浆Gln浓度明显低于烧伤前,而REE、DAO、TNF、LPS及IL-1水平则明显高于烧伤前。两组相比,烧伤后Gln组大鼠的血浆Gln浓度明显高于B组,增幅约达40%,而REE、DAO、LPS、TNF及IL-1水平则明显低于B组。相关分析显示,REE与血浆Gln浓度呈显著负相关(r=-0.89,P<0.01)。结论:Gln强化的肠内营养可有效地提高烧伤大鼠的血浆Gln浓度,减轻肠道受损程度,抑制炎症介质的释放,从而降低肠源性高代谢。     

缺氧血管内皮细胞Rho激酶信号通路活化与通透性的关系

目的 探讨缺氧时血管内皮细胞Rho激酶信号通路活化与通透性的关系. 方法 (1)将人血管内皮细胞株VE细胞接种于6孔板Transwell小室上,按随机数字表法分为对照组(未行缺氧处理)及缺氧1、2、3、6、12h组(分别缺氧处理相应时间),每组5孔.用蛋白质印迹法检测细胞中Rho激酶Ⅰ、Ⅱ及肌球蛋白轻链磷酸酶靶亚单位1(MYPT1)、磷酸化MYPT1( p-MYPT1)、肌球蛋白轻链(MLC)、p-MLC的蛋白表达,计算p-MYPT1/MYPT1、p-MLC/MLC比值.(2)将VE细胞接种于24孔板Transwell小室上,按随机数字表法分为对照组(未行缺氧处理)与缺氧6h组(缺氧处理6h),每组5孔,用荧光分光光度计检测单层细胞通透性.对数据进行单因素方差分析或t检验,多组间两两比较采用Newman-Keuls法. 结果 (1)对照组及缺氧1、2、3、6、12h组细胞Rho激酶Ⅰ蛋白表达量分别为0.63±0.14及0.36±0.08、1.25 ±0.21、1.98±0.16、1.49 ±0.38、0.79±0.24(F=36.52.P ＜0.01),其中缺氧2、3、6h组显著高于对照组(P值均小于0.01).各组细胞Rho激酶Ⅱ蛋白表达量比较,差异具有统计学意义(F =17.84,P＜0.01),其中缺氧2h组为1.33±0.17,显著高于对照组的1.05±0.04(P＜0.01).对照组及缺氧1、2、3、6、12h组细胞p-MYPT1/MYPT1比值分别为0.62±0.13及0.62±0.11、0.65 ±0.10、1.06±0.23、1.37 ±0.16、1.91±0.32(F=37.41,P＜0.01),其中缺氧3、6、12h组显著高于对照组(P值均小于0.01).对照组及缺氧1、2、3、6、12h组细胞p-MLC/MLC比值分别为0.72 ±0.19及0.83 ±0.17、0.91±0.15、1.39 ±0.16、2.02±0.15、0.90±0.25(F=36.92,P＜0.01),其中缺氧3、6h组显著高于对照组(P值均小于0.01).(2)缺氧6h组单层细胞通透性为36.1±8.0,显著高于对照组的9.1±2.1(t=7.30,P＜0.01). 结论 Rho激酶信号通路活化可能参与了缺氧引起的血管内皮通透性增加的发生.     

联合检测CNRIP1和SNCA甲基化在结直肠癌及其癌前病变筛查中的作用

目的:探讨粪便中正大麻受体相关作用蛋白1(cannabinoid receptor interacting protein 1,CNRIP1)和α-突触核蛋白(synuclein-alpha,SNCA)基因甲基化状态及其在结直肠癌和癌前病变中的价值。方法:收集60例结直肠癌、30例腺瘤、20例增生性息肉患者及25名健康人群的清晨粪便标本,采用甲基化特异性PCR技术分析CNRIP1和SNCA的甲基化状态。分析其与结直肠癌临床病例特征的关系,并比较两个基因甲基化单独检测或联合检测与粪便隐血(fecal occult blood test,FOBT)的诊断敏感性。结果:结直肠癌患者粪便DNA中CNRIP1和SNCA基因启动子甲基化率分别为73.3%和60.0%,腺瘤患者分别为56.7%和46.7%,增生性息肉患者分别为20.0%和15.0%,正常对照人群分别为8.0%和4.0%,结直肠癌患者和腺瘤患者无显著性差异,但与其他各组存在显著性差异(P<0.05)。2个基因甲基化状态与结直肠癌患者的临床病理指标无明显相关性。CNRIP1和SNCA的甲基化诊断结直肠癌的敏感性分别为73.3%和60.0%,联合检测的敏感性为86.7%,明显高于FOBT的33.3%,而联合检测与单独检测无明显差异。结论:粪便中CNRIP1和SNCA基因启动子甲基化水平在结直肠癌和腺瘤患者中明显升高,其联合检测有望成为结直肠癌及其腺瘤等癌前病变筛查的理想非侵入性检测方法。