骨桥蛋白基因质粒的构建及慢病毒包装的实验研究

目的:构建骨桥蛋白(OPN)基因的重组质粒,并包装慢病毒。方法:从C57BL/6野生型小鼠肾脏组织提取总RNA,逆转录为cDNA经特定引物扩增出OPN基因片段,并大量扩增,利用基因重组技术该基因片段与慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-T2A-Puro连接形成重组质粒,该重组质粒转染293T细胞进行慢病毒包装后测定滴度。结果:DNA测序证实提取的基因为OPN片段,慢病毒滴度达2.5×108 TU/ml。结论:成功包装了含有OPN基因片段的慢病毒,为进一步研究OPN对各种细胞的生物学功能的影响奠定了基础。     

骨母细胞特异性因子2介导间充质干细胞调控瘢痕疙瘩样瘤体生长的研究

目的探讨骨母细胞特异性因子2(Periostin)调控瘢痕疙瘩间充质干细胞(KMLSCs)对体外及裸鼠体内瘢痕疙瘩样瘤体生长的影响。方法从瘢痕疙瘩中分离培养KMLSCs,设置实验Periostin干扰组、空载体组和未转染组,根据干预目的构建Periostin慢病毒载体并转染对应组细胞。利用Western Blot技术体外检测各组细胞Periostin、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和血管内皮生长因子(VEGF)的表达情况;制备丝素蛋白-壳聚糖支架复合体,与细胞共培养后,扫描电镜观察支架的结构、KMLSCs的生长情况。建立裸鼠皮下瘢痕疙瘩样瘤体移植模型,移植8周后取出瘤体,测量3组肿瘤体积,通过荧光共聚焦技术检测各组组织中Periostin、α-SMA、VEGF以及Western Blot技术评估Erk的表达情况。结果体外培养的3组KMLSCs中Periostin在空载体组和未转染组有表达,而干扰组则表达微弱;同时3组细胞均不表达α-SMA和VEGF。制备的支架复合体呈多孔结构,KMLSCs在复合体支架中生长良好;各分组瘤体移植模型在体内裸鼠皮下成活良好。干扰组中Periostin表达下调后,瘤体体积显著减小,同时α-SMA、VEGF、Erk表达减弱,差异有统计学意义(P 0. 05),并呈现一致性。结论 Periostin可能通过调控KMLSCs的功能,参与了模型中瘢痕疙瘩样肿块的生长。     

分泌型凋亡相关蛋白1调控成纤维细胞凋亡的研究

目的探讨分泌型凋亡相关蛋白1（secretedapoptosis-relatedprotein1,SARP1）调控增生性瘢痕患者的成纤维细胞（fibroblast,FB）凋亡的作用。方法构建SARP1腺病毒载体（Ad-sARPl）．感染瘢痕患者的皮肤FB,促进其表达SARP1蛋白,观察其蛋白表达后人FB增殖与凋亡的变化,明确SARP1蛋白对FB的调控作用,并通过转移酶介导的三磷酸脱氧鸟苷-生物素刻痕末端标记（TuNEL）方法、流式细胞仪（FACs）分析细胞增殖与凋亡动态变化。结果成功构建Ad-SARP1,并能够感染人FB,通过逆转录一聚合酶链式反应（RT-PCR）检测到SARP1的mRNA值明显增加,Western印迹方法检测SARP1蛋白表达明显增多（P〈0．05）;其蛋白表达后四甲基偶氮噻唑蓝（MTT）法检测,与带荧光的腺病毒空载体（Ad-EGFP）及对照组相比,Ad-SARP1感染的FB增殖活力均显著增高;TUNEL检测Ad-SARP1感染FB前后细胞凋亡结果显示,细胞凋亡明显受到抑制,凋亡阳性细胞变少,接近瘢痕成纤维细胞（HSFB）凋亡;FACS分析表明,感染组FB的细胞凋亡指数与对照组相比明显下降（P〈0．01）。结论sARP1参与调控增生性瘢痕患者的FB功能,抑制细胞凋亡,促进细胞增殖加快。     

新型前置式脂肪抽吸针对移植脂肪成活影响的实验研究北大核心CSCD

目的探讨采用新型前置式脂肪抽吸针抽取脂肪对移植后脂肪成活的影响。方法选择1例行腹部脂肪抽吸术女性患者,其左、右侧腹部分别采用新型前置式脂肪抽吸针(实验组)和传统侧孔抽脂针(对照组)抽取脂肪。通过扫描电镜观察及葡萄糖转移实验,比较两组脂肪细胞体外活性差异。于20只裸鼠背部左、右侧各取1处,分别注射两组脂肪至皮下,每处注射400 mg脂肪。注射后4、12周,观察注射区反应后,取出移植物行大体观察、残留质量测量,组织学观察脂肪细胞,免疫组织化学染色观测微血管密度(microvessel density,MVD)。结果扫描电镜观察示,与对照组相比,实验组脂肪细胞饱满均一、脂肪血管结构更丰富;实验组葡萄糖转移量为(3.049±0.266)mmol/L,明显高于对照组的(2.668±0.250)mmol/L(t=2.956,P=0.010)。裸鼠体内注射后4周,仅对照组1处注射区发生脂肪液化;注射后4、12周,与对照组相比,实验组脂肪细胞形态更清晰、血管更丰富、坏死更少;实验组移植物残留质量、MVD均高于对照组,比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论新型前置式脂肪抽吸针能减少抽吸过程中对脂肪细胞的损害,进而提高移植脂肪成活率。     

《整形外科学》网络课程的构建

网络课程建设是当前医学教育教学改革的重要课题。探索如何构建具有自身特色的《整形外科学》网络课程系统,从课程的设计思路、设计体系出发,详细介绍课程构建的基本内容和构架。总结《整形外科学》网络课程的特色,其多媒体设计形象、多样、直观以及交互性强的特点,可充分发挥学生的自主学习能力,是课堂教学和临床带教的良好补充。     

烧伤后早期增生性瘢痕相关细胞骨架基因表达研究

目的　筛选烧伤后早期增生性瘢痕细胞骨架相关基因 ,并探讨其在瘢痕挛缩产生中的作用。　方法　以包含 4 0 96种人类基因的基因芯片研究烧伤后早期增生性瘢痕组织中相关细胞骨架基因表达 ;并利用原位杂交技术观察其中一条基因在烧伤后早期增生性瘢痕组织中的定位分布表达。　结果　在 3例临床标本中 ,共找到瘢痕相关细胞骨架基因 13条 ,均表达上调。在烧伤后早期增生性瘢痕组织中 ,表达人成纤维细胞肌原蛋白基因的细胞明显增多。　结论　烧伤后早期增生性瘢痕组织中就发生了多种细胞骨架相关基因表达上调 ,这可能是烧伤后增生性瘢痕挛缩的重要原因。     

重组正反义α-SMA逆转录病毒载体对瘢痕与皮肤成纤维细胞的影响

目的 利用α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)基因重组反义和正义逆转录病毒载体，探讨α-SMA逆转录病毒对瘢痕与皮肤成纤维细胞的影响。方法 用含α-平滑肌肌动蛋白cDNA，重组反义和正义逆转录病毒载体，并感染培养的瘢痕和皮肤成纤维细胞，进行α-SMA在蛋白水平表达等的研究，观察瘢痕与皮肤成纤维细胞形态学与功能的变化。结果 反义α-SMA逆转录病毒抑制了瘢痕成纤维细胞的增殖，细胞形态变小；α-SMA在瘢痕与皮肤成纤维细胞表达降低，并随着作用时间延长，效果更明显；正义α-SMA逆转录病毒则具有相反的作用，促进α-SMA的表达。结论 α-SMA重组病毒对瘢痕与皮肤成纤维细胞的形态、生长、细胞功能均有影响。     

CTLA4Ig表达质粒的基因枪转染皮肤及细胞的实验研究

目的 利用基因枪技术提高CTLA4Ig的cDNA的转染效率。方法 设基因枪局部转染组，注射器局部注射组和肌肉注射组，并构建pCTLA4Ig-IRES2-EGFP表达载体，将质粒注射入皮肤，观察三种方法转移CTLA4Ig目的DNA的存留时间。同时，体外培养ECV，293细胞，用基因枪或逆转录病毒载体转染上述质粒，观察质粒的转染及表达情况。结果 基因枪转移基因至细胞，皮肤的效率明显好于其他方法，但对细胞，基因枪的初始压力不能太高，否则，细胞容易死亡。结论 基因枪转染CTLA4Ig质粒效率较高。     

猴移植皮肤感觉再生的实验研究

目的移植皮肤的感觉再生缺乏深入的实验研究。通过恒河猴额部与手指掌侧无毛皮肤的相互移植,观察无毛皮肤移植后感觉小体再生过程与再生类别。方法实验用恒河猴2只,随机抽取前肢指4个,将指腹与额、臀部的无毛皮对换移植,在3,9个月时切取标本进行抗神经丝免疫组化与电镜观察。结果移植皮肤在3个月时神经末梢与触觉小体开始不典型再生;9个月的皮肤内已有典型的再生触觉小体,而上皮细胞—轴突复合体内有神经长入;移植皮肤内有较多的再生触觉小体,上皮细胞—轴突复合体有完整的再生结构。结论移植皮肤内存在感觉小体的再生,这些结构与移植后的功能需要有关。