浅论硕士研究生细胞培养实验的教学

细胞培养技术现已广泛应用于生物医学各领域。 1996年始我室向硕士研究生开设细胞实验课程,32学时, 8个实验,2个学分。目前已建立一套适合培养硕士生学习的实验教材、教学资料和能让270位学生在14d 内完成     

肺泡灌洗液中SHOX2和RASSF1A基因

摘 要：［目的］ 评估肺泡灌洗液（BALF）中SHOX2和RASSF1A基因甲基化联合检测（任意阳性）在肺癌诊断中的临床价值。［方法］收集经病理确诊的580例患者,其中肺癌261例,良性肺部疾病293例,非肺部的恶性肿瘤26例。将良性肺部疾病和非肺部的恶性肿瘤患者共319例作为对照组。对全部580例患者的BLAF样本,采用实时荧光PCR（RT－PCR）与测序法检测BALF中SHOX2和RASSF1A两种基因甲基化情况,比较两种检测方法的一致性。以病理诊断为金标准,对277例具有细胞学结果的患者(肺癌组130例,对照组147例),比较采用RT－PCR法SHOX2和RASSF1A基因甲基化检测与细胞学检测对肺癌诊断的敏感性和特异性。［结果］ RT－PCR法与测序法两种方法检测580例患者BLAF样本SHOX2基因和RASSF1A基因甲基化结果的一致率分别是97.5%和98.0%。580例BLAF样本采用RT－PCR法检测SHOX2和RASSF1A基因甲基化任意阳性对肺癌诊断的敏感性和特异性分别是74.3%和87.1%。在277例有细胞学结果的患者中,RT－PCR法SHOX2和RASSF1A基因甲基化检测任意阳性对肺癌诊断的敏感性和特异性分别为83.2%和92.5%,与细胞学检测（44.6%和98.6%）相比,敏感性显著提高,但特异性有所降低,差异均有统计学意义（P<0.01,P<0.05）。基因甲基化联合检测（任意阳性）阳性率在细胞学发现癌细胞组为98.2%（57/58）,结果未明组为100.0%（35/35）,未发现癌细胞组为37.8%（14/37）。［结论］ 采用RT－PCR法进行BALF中SHOX2和RASSF1A基因甲基化联合检测,可以作为肺癌细胞学检查的补充,特别是在细胞学检测结果未明或阴性时。     

分离病鸡3株大肠埃希菌的鉴定及毒力和细胞毒测定

目的分离病鸡中3株大肠埃希菌和鉴定其对小鼠的致病力及对Vero细胞毒性作用.方法将按常规细菌的分离并鉴定的3株大肠埃希菌,接种至昆明系小鼠体内做毒力试验,计算死亡率和LD50(50%致死量).采用微量单层细胞培养法测定细菌上清液的细胞毒性作用.结果分离的3株细菌生物学性状均符合大肠埃希菌.分离的3株细菌对小鼠致病率为100%;菌量达6×1011CFU/L时死亡率为100%;LD50为1.5×1010 CFU/L.分离的3株细菌对2株细胞均无细胞毒性作用.结论分离的3株致病性大肠埃希菌与O157∶H7 株对小鼠致病力相似,可能是潜在的人类的传染源.     

育龄妇女ToRCH感染及与异常妊娠关系的研究

目的研究育龄妇女ToRCH系列感染及其与异常妊娠结局的关系.方法采用间接ELISA对250例育龄妇女作4种ToRCH病原体抗体检测,部分IgM(或IgG)阳性病例并作PCR检测.对其中21例异常妊娠结局的胚胎组织块作了PCR检测和对10例异常新生儿作了血清学诊断.结果250例育龄妇女ToX、RubV、CMV、HSVIgM阳性率分别为8.0%、12.8%、6.8%和8.4%,并发现同一病例有两种或两种以上病原体同时感染的情况,PCR结果与之基本一致.21例与ToRCH感染有关异常妊娠结局(流产、早产、死胎、先天缺陷)孕妇均有ToRCH中的一种、2种或2种以上病原体感染,从死胎脑组织块、人工流产混合物的PCR结果与之吻合.10例新生儿脑炎血清与对应母亲血清抗体检测表明,垂直传播率ToX与CMV分别为50%和40%.结论ToRCH系列感染与异常妊娠结局的关系十分密切.     

5-氟尿嘧啶对瘢痕疙瘩成纤维细胞Smad7和转化生长因子βⅠ型受体表达的影响

背景:很多实验已证明5-氟尿嘧啶应用于瘢痕疙瘩治疗可收到良好的效果.但作者所查针对5-氟尿嘧啶经由转化生长因子β信号通路作用于瘢痕疙瘩分子机制的报道较少.目的:实验拟观察5-氟尿嘧啶对瘢痕疙瘩成纤维细胞Smad7和转化生长因子βⅠ型受体表达的影响.设计、时间及地点:细胞观察实验,于2007-02/10在安徽医科大学微生物教研室完成.材料:标本分别取自因瘢痕疙瘩入院的6例整形手术患者.方法:①瘢痕疙瘩组织成纤维细胞原代培养,取4～6代传代细胞加入5个不同浓度5-氟尿嘧啶(10,20,40,80,160 μmol/L)干预24,48,72 h.②待细胞长至80%汇合时,加入5-氟尿嘧啶配成10,20,30 μmol/L 3个药物干预浓度组,每组再加入转化生长因子β1继续培养.设空白对照和单纯加转化生长因子β1(5 μg/L)的阳性对照.主要观察指标:①利用四甲基偶氮唑盐法测定瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖能力.②蛋白免疫印迹检测各组瘢痕疙瘩成纤维细胞中Smad7和转化生长因子βⅠ型受体的表达.结果:①5-氟尿嘧啶浓度为10,20 μmol/L 作用24 h 时未发现成纤维细胞死亡,与空白对照组相比差异无显著性意义(P > 0.05);其他浓度下作用各组均有显著的成纤维细胞死亡现象(P < 0.01).②与空白对照组相比,转化生长因子β1组Smad7表达明显减弱,转化生长因子βⅠ型受体表达则显著增强(P均 < 0.01).③加入5-氟尿嘧啶干预后可显著增强Smad7的表达,且在5-氟尿嘧啶浓度为20 μmol/L 时的表达最强(P < 0.01).④不同浓度5-氟尿嘧啶对转化生长因子βⅠ型受体表达无明显影响.结论:5-氟尿嘧啶浓度为10～20 μmol/L 时无细胞毒性,与转化生长因子β1共同培养成纤维细胞,能够提高该细胞转化生长因子β1诱导的Smad7表达,但对于转化生长因子βⅠ型受体的表达没有明显影响.     

非特异性下腰痛患者血清中人巨细胞病毒pp65抗体检测与腰背痛的相关性

目的:通过对非特异性下腰痛患者血清中人巨细胞病毒pp65抗体的检测,试图探究人巨细胞病毒潜伏感染在非特异性下腰痛中的潜在致病作用.方法:实验于2002-05/2004-01在安徽医科大学第一附属医院康复医学科门诊完成.比较3组不同人群外周血清人巨细胞病毒pp65 IgM抗体阳性水平.分别采集3组空腹静脉血2 mL,作为待检血清.用间接酶联免疫吸附法即人巨细胞病毒pp65重组蛋白抗原包被96孔酶标板,依次加入待测血清.经酶标抗人抗体显色后,用酶标仪(BIO-RAD,model550,USA)测定A值.结果以(样品A450-本底)&;#247;(对照组A450-本底)≥2.1判为阳性.结果:非特异性下腰痛组人巨细胞病毒pp65 IgM阳性率为48.21%(27/56),高于健康大学生组的17.86%(5/28),差异有显著性意义(x^2=7.294,P=0.007);非特异性下腰痛组的人巨细胞病毒pp65IgM阳性率高于脑瘫患儿组的26.42%(14/53),差异有显著性意义(x^2=5.514,P=0.019).结论:非特异性下腰痛患者出现腰痛症状时可能与人巨细胞病毒的再激活有关,但需进一步确定人巨细胞病毒pp65抗体阳性水平与临床症状的相关性、是否需要相应干预和干预后的变化,以及进行相应组织细胞的病毒分离从而获得腰痛与人巨细胞病毒再激活感染病源学结论的直接证据.对人巨细胞病毒感染与非特异性下腰痛的相关性进行开创性研究,从而为进一步研究非特异性下腰痛的可能病因及其发生机制、临床诊治提供新依据.     

下腰痛症状与巨细胞病毒感染

目的:探寻人巨细胞病毒感染与下腰痛存在的相关性,旨在进一步阐述下腰痛的可能病因。资料来源:应用计算机检索Medline 1992-01/2004-04的文章,检索词为“backpain,human cytomegalovirus,virus”,限定文章语言种类为Eng-lish。同时检索http://www.wanfangdata.com.cn/1998-01/2004-12的文章,检索词为“腰痛、人巨细胞病毒”,限定文章语言为中文。资料选择:纳入标准:①腰痛的病因学研究。②人巨细胞病毒感染与疼痛的相关研究。排除标准:①较陈旧的文献。②重复研究。③综述文献。资料提炼:共检索到181篇巨细胞病毒感梁与下腰痛相关文献,其中25篇符合标准,排除的其余文章系同一类的重复性研究、较陈旧的及综述文献。资料综合:①下腰痛简介:成年人中60%～80%有下腰痛史,但85%的下腰痛原因不明,临床上不能针对病因开展有效治疗,由此导致5%～10%的下腰痛转为慢性或致残,因而倍受国内外学者关注。Muneshige等指出病毒感染理论是揭开慢性局部疼痛之谜有吸引力的假说。②人巨细胞病毒简介:成年人群中人巨细胞病毒感染非常普遍,其抗体阳性率为40%～100%。人巨细胞病毒感染的临床类型分为亚临床感染/隐性感染和症状性感染。③人巨细胞病毒可能引起下腰痛的途径:有先天性感染、围生期感染和后天性感染;试验研究显示许多脊柱结构,包括韧带、平面关节、椎骨骨膜、椎骨周围的肌肉和筋膜、血管、纤维环和脊神经根病变可导致下腰痛。结论:人巨细胞病毒感染与下腰痛可能具有相关性,但其确切关系尚待进一步观察验证。     

新生和成年大鼠雪旺细胞培养、纯化的实验研究

目的：比较新生和成年大鼠雪旺细胞（Schwann cells，SCs）的体外培养和纯化方法。方法：分别取新生和成年SD大鼠的坐骨神经，用混合酶消化法、差速贴壁法和低浓度胰酶快速消化法进行培养和纯化，通过形态学观察和S-100免疫细胞化学鉴定，并行MTF法检测细胞增殖能力。结果：两组细胞生长状态良好，均呈S-100免疫细胞化学反应阳性，纯度均达95％以上；由生长曲线显示新生鼠SCs生长更快，第2代SCs倍增时间：新生鼠3d、成年鼠4d。结论：从新生和成年大鼠坐骨神经能成功分离培养出大量高纯度的SCs，新生鼠SCs增殖能力更强。     

糖尿病患者低血糖与心血管疾病的关系

控制血糖是糖尿病治疗的首要目标,但在降糖过程中,难以避免的低血糖会减少降糖益处,甚至增加死亡风险.近年来研究发现,低血糖可以改变心血管系统神经内分泌和电生理、损害血管内皮,进而诱发糖尿病急性心血管事件或加快慢性并发症进程.低血糖的发生会抵消糖尿病患者一生高血糖治疗所带来的益处.现将低血糖与糖尿病患者心血管疾病的关系作一综述.     

人巨细胞病毒先天性感染胎鼠致肝脏损伤的小鼠模型

目的：探讨人巨细胞病毒（HCMV）先天性感染致肝脏损伤的病理机制,建立HCMV先天性感染胎鼠致肝脏损伤的小鼠模型。方法：将不同剂量的HCMV接种至10周龄Balb/c雌雄小鼠腹腔后交配,待雌鼠临产时,剖腹取出胎鼠肝脏,进行病毒分离,病理学检查和HCMV,DNA原位杂交检测。结果：在接种6．0log TCID50 HCMV组胎鼠的肝组织匀浆上清液中分离出HCMV;在病毒分离出现典型细胞病变效应（CPE）的细胞培养液中检测出HCMV DNA;原位杂交证实病毒核酸存在于肝细胞核内和胞浆内;病理学证实肝组织有炎性改变,肝细胞浊肿变性;核内有特异性HCMV包涵体,部分肝细胞呈坏死表现,3．0log TCID50组原位杂交见肝细胞核内和胞浆内有少量病毒核酸存在,病理结果表明肝组织仅有轻度炎性改变和肝细胞浊肿变性,上述表现在1．5log TCID50组均不明显,与正常对照组相似。结论：HCMV可以通过胎盘造成胎鼠的先天性感染,导致肝脏损伤,并与母体感染的病毒量有关,该模型的建立为进一步研究人类先天性HCMV感染造成肝脏损伤的病理过程以及对先天性感染的预防,诊断和抗病毒药物的筛选提供了可能。