乙型肝炎病毒聚合酶基因重组腺病毒表达系统的构建和初步鉴定

目的 构建乙型肝炎病毒聚合酶基因（RT/RNaseH区段）腺病毒表达系统并初步鉴定其转录表达。方法 采用PCR方法从pU19-1.24HBV质粒中扩增RT/RNaseH区段,将该片段与pCMV-Tag2载体连接构建腺病毒穿梭载体,将其在Bj5183细菌中重组,获得的重组质粒转染到Ad293细胞中包装,待细胞裂解后收集含病毒的上清并感染Huh7细胞,48h后通过RT-PCR鉴定目的基因转录。结果 成功扩增HBV RT区并插入pCMV-Tag2载体,成功获得腺病毒重组质粒并在AD293中包装成病毒颗粒,病毒颗粒感染Huh7细胞后RT-PCR能在Huh7细胞中检测到HBV RT区段mRNA转录。结论 成功构建乙型肝炎病毒聚合酶基因RT/RNaseH区段的腺病毒表达系统,该系统能在Huh7细胞中转录,但逆转录蛋白的表达仍待进一步检测。     

贲门癌蛋白质组与病理分化程度的研究

目的：筛选贲门癌相关肿瘤标志。方法：IMAC3芯片及SELDI-TOF技术检测河南省林州市食管／贲门癌高发区47例贲门癌患者（贲门癌组）和50名健康人（对照组）血清标本，并对32例高、中分化腺癌（高分化组）和15例低分化腺癌（低分化组）及健康人（对照组）作了对比分析。结果：以M5908．48、M7943．64和M8938．70蛋白质组成的决策树模型对贲门癌组和对照组进行分析，测试的准确率、敏感度和特异度分别为77．3％、85．1％和70．0％。差异有统计学意义的蛋白中，相对分子质量为4211．29、5334．13、5966．63、5903．14、11735．71、5922．70、7932．54、7758．66、9287．40和6109．99，上调组蛋白质中，9／10相对含量在3组中比较为：对照组〈高分化组〈低分化组；相对分子质量为8992．89、8158．48、8924．27、4495．96、9434．40、5099．02、6661．72、6222．12和6960．60下调组蛋白质中，6／9为：对照组〉低分化组〉高分化组。结论：5908．48、7943．64和8938．70蛋白质组成的决策树模型可以对贲门癌进行诊断，具有较高的敏感度和特异性；上调组蛋白质在血清中的相对含量与分化程度呈负相关，下调组蛋白质与肿瘤的分化程度也明显相关。     

奥沙利铂联合卡培他滨治疗晚期胃癌临床疗效观察

目的评价奥沙利铂联合卡培他滨治疗晚期胃癌临床疗效与不良反应。方法采用随机分组的方法,将61例胃癌患者分为两组,治疗组病人30例,采用XELOX方案(奥沙利铂65mg/m2静脉滴注d1、8,卡培他滨1250mg/m2.d)分两次口服d1～15),每三周重复一次;对照组病人31例,采用FOLFOX6方案(奥沙利铂100mg/m2静脉滴注d1,亚叶酸钙400mg/m2静脉滴注2hd1,5-氟尿嘧啶400mg/m2静脉注射d1,5-氟尿嘧啶2400～3000mg/m2静脉滴注46小时),每3周重复一次,完成4周期后评价2组疗效。结果其中治疗组完全缓解(CR)2例(6.7%),部分缓解(PR)19例(63.3%),稳定(SD)4例(13.3%),进展(PD)5例(16.6%),有效(CR PR)为21例(70.0%);对照组完全缓解(CR)1例(3.2%),部分缓解(PR)12例(38.7%),稳定(SD)4例(12.9%),进展(PD)14例(45.2%),有效(CR PR)为13例(41.9%);治疗组不良反应主要为可逆的外周神经毒作用,其发生率高于对照组,而恶心呕吐等胃肠道反应较对照组明显降低。结论奥沙利铂联合卡培他滨治疗晚期胃癌近期疗效较好,不良反应较轻,是治疗晚期胃癌较好的有效方案。     

我国主要乙型肝炎病毒流行株中C抗原18～27位细胞毒性T淋巴细胞表位特点分析

目的 探讨我国HBV感染者中人类白细胞抗原(HLA)-A*0201限制性特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位HBcAg(18～27)V/I变异体的病毒学背景特点.方法 应用生物信息学方法分析GenBank中30条不同HBV基因型的病毒株HBcAg(18～27)区段的序列特点.设计错配引物,构建针对HBV B、C基因型HBcAg(18～27)V/I的PCR限制性片段长度多态性分析(RFLP)筛选方法.以PCR-RFLP和测序方法检测来自我国8省区160份HBV基因型B、C标本的HBcAg(18～27)V/I基因特点.用表位预测网站分析不同HBcAg(18～27)特异性CTL表位基因变异体与HLA-A*0201分子结合力的差异.结果 成功构建了针对HBV基因B、C型HBcAg(18～27)V/I的PCR RFLP筛选方法;在调查的HBV B、C基因型血清中发现HBcAg(18～27)V的阳性率仅为1.88%(3/160);生物信息学分析显示HBcAg(18～27)I与HLA-A*0201分子的结合力明显低于HBcAg(18～27)V(HLA Ligand评分123与156,SYFPEITHI评分22与24).结论 我国流行的主要HBV流行株中HBcAg(18～27)的最后一位氨基酸主要表现为异亮氨酸,而非缬氨酸;在进行细胞免疫学研究时,以HBcAg(18～27)V作为参照需要充分考虑这一病毒学背景.     

实时荧光聚合酶链反应检测HBV基因型方法的建立和临床研究

目的 建立实时荧光聚合酶链反应（PCR）检测乙型肝炎病毒（HBV）基因型方法并对检测的慢性乙型肝炎（CHB）患者基因型进行临床分析。方法 根据GenBank中已发表的明确分型的143株HBV全序列，设计特异的组合引物探针，建立实时荧光PCR方法，检测128例慢性乙型肝炎患者基因型；同时检测HBVDNA、HBV-M。结果 （1）128例标本中B型检出率为20．3％（26／128），C型占71．9％（92／128），D型占7．8％（10／128）；18株HBV克隆标本S基因测序结果与本分型法完全一致。（2）男性与女性的HBV基因型构成比无明显差异（P=0．561）。B型与C型比较，C基因型HBVDNA含量（P〈0．05）和HBeAg阳性率（P〈0．01）明显高于B基因型。基因型B具有更高的HBeAb水平（P〈0．05）。结论 （1）实时荧光聚合酶链反应HBV基因分型法能够简便、灵敏、快速、准确地鉴定HBV基因型。（2）HBV基因型主要以C型为主，其次为B型、D型。在CHB患者中，性别不是基因型构成差别的因素，C基因型易引起较重的肝脏病变，B型易发生免疫逃逸，致病情较轻。     

乙型肝炎病毒S基因插入和点突变株感染及其血清学特征

为探讨乙型肝炎病毒感染血清学不典型表现的分子病毒学基础,用聚合酶链反应产物直接序列分析测定中国人感染的ＨＢＶ Ｓ基因核苷酸序列。结果发现：１５例ＨＢｓＡｇ阴性ＨＢＶ感染者中,１例第５５２位碱基胸腺嘧啶被胞嘧啶,导致ＨＢｓＡｇ第１３３位蛋氨酸被氨酸替代;３例第５４６位碱基Ｃ被Ｔ替换,导致ＨＢｓＡｇ第１３１位苏氨酸被异亮氨酸替代。     

SARS冠状病毒的多组织嗜性及其全基因序列的测定

目的研究SARS冠状病毒对不同组织的感染情况,了解SARS流行初期病毒的基因组序列。方法用Trizol RNA抽提试剂提取因SARS病毒感染而死亡的3例死者不同组织中的总RNA,并逆转录为cDNA,然后用针对SARS病毒不同基因区间的引物进行PCR扩增,并对其中1例肺组织中病毒全序列进行了测定。结果3例病例中有2例仅在肺组织中扩增到病毒序列,另1例除在肺组织中检测到病毒外,还在气管、肾、淋巴结及肝组织中检测到病毒的存在。病毒全序列分析结果显示,该序列全长为29760个碱基,具有典型的冠状病毒序列特征,除具有RNA聚合酶基因和s、E、M和N4种结构蛋白基因外,还有另外8个蛋白编码框。经与GenBank上登录的部分其他SARS冠状病毒全序列进行比对,发现该序列除存在少量的SNP外,还多出一段29个核苷酸的序列,这段序列的存在完全改变了ORF10和ORF11两个蛋白编码框,使得在此终止的蛋白翻译能够继续进行下去,从而使ORF10和ORF11两个读框成为一个读框。结论SARS病毒具有多组织嗜性;该序列有可能是病毒从动物传到人的原始序列。     

SARS恢复期患者特异性IgG抗体滴度观察与分析

目的探讨SARS恢复期患者特异性IgG抗体滴度水平及变化趋势,完善SARS感染后免疫的资料。方法采用口。ISA法检测23例SARS患者发病后6个月、12个月2个时间点血清中特异性IgG抗体滴度。以单克隆抗体标记23例患者的PBMC,用流式细胞仪检测HLA-A2的阳性率。结果6个月时IgG抗体滴度的最高值为1：160阳性(4／23),最低值为1：10阴性(1／23),平均滴度为1：57;12个月时IgG抗体的最高滴度仅为1：80阳性(6／23),最低值为1：10阴性(2／23),平均滴度为1：27。2个时间点抗体滴度之间的差异有统计学意义(P=0．002)。23例患者中HLA-A2阳性14例,阳性率60．9％。结论SARS恢复期患者的抗体滴度在半年以后已呈现明显的下降趋势,目前所依据的SARS-IgG抗体诊断标准是合理可行的。HLA-A2抗原肽疫苗可以治疗和预防50％左右的SARS病毒感染。     

应用腺病毒载体系统将HBV/C全基因组转导入HepG2细胞的方法学研究

目的 运用腺病毒系统将HBV/C全基因组高效地导入肝癌细胞系,为研究HBV的复制及蛋白表达情况构建技术平台.方法 构建HBV/C基冈型毒株的1.3拷贝全基因序列,运用腺病毒系统(AdEasy),首先将1.3拷贝HBV全基因序列插入到穿梭载体pAdTrack,经测序证实插入序列的正确性后用Pme I酶切线性化重组穿梭质粒,转化Adeasier-I感受态细胞,在细菌细胞内发生同源重组,所得重组腺病毒质粒pAdEasy-HBV/C用PacI酶切线性化,用脂质体法转染293细胞来包装重组病毒.用适量感染复数的重组腺病毒感染HepG2细胞,并对感染细胞上清中的HBV DNA、HBeAg和HBsAg分别进行了定量检测.结果 成功运用腺病毒系统将1.3拷贝HBV全基因组高效率地导入HepG2细胞,导入的HBV能够运用自身的复制调控元件进行病毒的复制和蛋白表达.结论 运用AdEasy系统能够简便、快速、高效地将HBV全基因组导入肝癌细胞系,为抗病毒药物的筛选及评价提供了有效的技术平台.     

E645R变异MXA蛋白抗HBV复制体外研究

目的研究E645R变异MXA蛋白抑制乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)复制活性。方法对pcDNA3.1-MXA重组质粒采用定点突变构建E645R变异MXA蛋白表达重组质粒pcDNA3.1-MXA-E645R。将pcDNA3.1-MXA(MXA组),pcDNA3.1-MXA-E645R(E645R组)和pcDNA3.1空质粒(对照组)分别与PU19-1.24HBV重组质粒按2∶1比例瞬时共转染HepG2细胞,转染3d后检测MXA蛋白表达和各组细胞上清HBsAg和HBeAg的量以及上清和细胞内HBVDNA水平。结果酶切和测序表明定点突变成功构建pcDNA3.1-MXA-E645R重组质粒;MXA、E645R转染组有较好的MXA蛋白表达。E645R组与MXA组HBsAg较对照组分别下降23%和20%(P>0.05),E645R组和MXA组HBeAg较对照组分别下降61%和66%(P<0.05)。E645R组与MXA组上清HBVDNA水平较对照组分别下降1.9个和2.2个log值,细胞内HBVDNA水平均下降1.7个log值。结论E645R变异MXA蛋白具有较好的抗HBV活性,E645R变异不影响MXA蛋白抑制HBV复制。