HBV A83点变异真核表达载体的构建及其在HepG2细胞中的表达

研究A83点突变的生物学意义。采用分子生物学方法，设计引入KpnⅠ和HindⅢ酶切位点的引物扩增乙型肝炎病毒（HBV）ayw亚型的PcP10标准株中的Pre-C/C片段（1814-2452），经KpnⅠ和HindⅢ双酶切后，在T4DNA连接酶的作用下连于EB病毒真核表达载体。利用定点突变技术对连接载体进行1896点的定点诱变，经错配PCR-RFLP和测序分析。确定突变的克隆，提取突变前后的质粒转染HepG2细胞。突变后在Pre-1C/C第28位氨基酸形成终止密码。HBVA83点突变真核表达载体的构建为体外研究该点突变对HBeAg表达的影响以及HBeAg阴性的乙型肝炎病毒感染的致病机理奠定基础。     

拉米夫定治疗过程中HBeAg血清学转换及其影响因素

目的:探讨拉米夫定治疗患者HBeAg血清学转换的发生率及其影响因素。方法:分析了在我科接受拉米夫定治疗的163例HBeAg阳性患者的临床资料,分析了年龄、性别、肝功能、HBVDNA水平对HBeAg血清学转换的发生率的影响。结果:HBeAg累积血清学转换率随着治疗时间的延长逐渐增高,1年为16.08%,2年为33.75%,3年为47.00%。治疗前ALT水平高于3倍正常上限(120IU/L)者发生血清学转换比例明显高于低于3倍正常上限者。结论:接受拉米夫定治疗前ALT水平较高者获得持续应答的可能性更高。     

三种基因亚型乙型肝炎病毒感染者的临床资料与病毒学指标差异分析

目的 调查HBV Ba、C1和C2三种基因亚型在临床致病性方面的差异,同时检测并分析三种基因亚型毒株在前C和C基因启动子区发生变异的模式.方法 采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)法对来自广东地区151例慢性HBV感染者血清进行HBV基因亚型分析,同时测定所有标本前C及C基因启动子区的序列.结果 151份样本中Ba亚型占53.0%(80/151),C1亚型占33.8%(51/151),C2亚型占13.2%(20/151).三种亚型的患者在年龄和性别构成比无差异的情况下,其HBeAg阳性率以及多项肝功能指标差异均无统计学意义,但在前C及C基因启动子区的变异模式上存在明显差异:Ba亚型易发生A1896终止密码变异,T1762/A1764变异的发生概率较低;C1亚型易发生T1762/A1764变异,A1896变异发生概率较低;C2亚型发生T1762/A1764和A1896变异的概率介于Ba和C1亚型之间.结论 三种HBV基因亚型毒株可能采取不同的变异模式形成HBeAg阴性HBV感染.     

海南地区HBV基因分型与YMDD变异

本研究旨在探讨海南地区慢性乙型肝炎病毒发生YMDD变异与基因型之间的关系. 材料和方法 一、病例选择     

乙型肝炎病毒拉米夫定耐药毒株的全基因质粒构建及其在HepG2细胞中复制与表达

目的 探讨拉米夫定耐药变异对病毒复制及抗原表达的影响.方法 通过定向点突变方法,成功的在模板质粒P3.8Ⅱ基础上构建成功3种P基因变异株质粒,并转染HepG2细胞,与HBV野毒株相比,分析变异毒株复制表达活性的差别.结果 经DNA测序证实,成功构建了rtG172E、rtG174C、rtG172E/rtG174C等3种变异株质粒,转染细胞系后发现上清均表达有HBsAg和HBeAg,证明转染质粒在细胞内成功表达并分泌HBsAg和HBeAg.通过检测细胞内复制产生的子代HBVDNA发现,rtG172E、rtG174C、rtG172E/rtG174C等3种变异株的复制活性均有明显减弱.结论 新发现的3种P基因变异株会影响HBV复制活性,对药物敏感性的影响需进一步研究.     

中国广东地区乙型肝炎病毒基因亚型的分布

目的调查中国广东地区乙型肝炎病毒(HBV)基因型,主要是基因亚型的分布情况.方法应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性法以及序列测定法,对广东地区417例慢性HBV感染者血清进行研究.结果广东地区流行的HBV基因型主要为B型和C型,其中B型为Ba亚型,未发现Bj亚型的存在.C亚型有C1和C2两个亚型,其中C1占63%,C2占37%.结论广东地区流行的HBV基因型以Ba和C1亚型为主,C2亚型较少,Bj亚型极为罕见.     

重组乙型肝炎病毒P22e基因在HepG2细胞中的表达

目的:利用pCDNA3.1 真核表达载体,建立了稳定表达乙型肝炎(HBV)P22e的HepG2细胞系,用以研究HBVP22e与乙型肝炎发病机制的关系. 方法:以含1.2 copies HBV基因(adr亚型)p3.8II质粒为模板,PCR获得HBVP22e cDNA片段,分离插入通用T载体pMD18-T中鉴定,然后装入真核表达型载体pCDNA3.1 中,脂质体转染HepG2细胞株,免疫组化鉴定细胞内表达,微粒子免疫检查培养上清中分泌抗原. 结果:成功构建了真核表达载体pCDNA3.1 HBVP22e,并转染HepG2细胞,经多次传代培养鉴定,获得稳定表达HBVP22e的HepG2细胞系. 结论:HBVP22e可在HepG2中表达.     

12项肿瘤标志物检测在5种常见恶性肿瘤诊断中的应用

目的:探讨多项肿瘤标志物检测在5种常见恶性肿瘤诊断中的应用价值。方法:采用蛋白质芯片技术检测常见恶性肿瘤218例(其中肺癌51例,肝癌46例,胃癌28例,乳腺癌15例,食管癌55例,贲门癌23例)、健康体检者50例血清12种肿瘤标志物(CAl9-9、NSE、CEA、CA242、Ferretlng、Bet-HCG、AFP、Free-PSA、PSA、CA-125、HGH、CAl5-3)水平。结果:五种常见恶性肿瘤的阳性率为41.3%(90/218),其中肺癌阳性率为49.0%(25/51);肝癌阳性率为69.7%(32/46);胃癌阳性率为32.0%(9/28):乳腺癌阳性率为33.3%(5/15);食管癌阳性率为20.0%(11/55):贲门癌阳性率为34.8%(8/23),显著高于健康对照组4.0%(2/50)。而且多项肿瘤标志物联合检测对常见恶性肿瘤的检出率明显高于单一肿瘤标志物的监测。结论:多项肿瘤标志物蛋白芯片检测可以显著提高常见恶性肿瘤的诊断的敏感性,具有一定的临床应用价值。     

双向流动片层透析式空间细胞培养及其地基模拟装置

在微重力环境下的细胞培养方法不同于传统的地面上的细胞培养技术。它必须解决以下问题：（1）微重力环境下,重力才流趋于消失。单靠扩散难以维持细胞正常生长所必须的化学微环境的稳态。放必须从传统的静态培养发展为动态（流动式）培养;（2）培养液流动引起的应力必然会影响细胞的结构和功能;（3）微重力环境下不允许气／液自由界面存在,故气体交换和供应和传统培养方法截然不同。为了适应微重力下细胞培养的要求,我们设计了双向流动片层透析式空间细haff养装置。双向流动片层透析式空间细胞培养装置由片层膜培养室。微型输液泵、气…     

EGFP-HBVP22e融合蛋白在HepG2中的表达

目的 利用pEGFP-C2真核表达载体,建立稳定表达乙型肝炎病毒(HBV)P22e的HepG2细胞系.方法 以含1.2拷贝HBV基因(adr亚型)的p3.8Ⅱ质粒为模板,PCR获得HBVP22e cDNA片段,分离插入通用T载体pMD18-T中鉴定,然后装入真核表达型载体pEGFP-C2中,HBVP22e与EGFP基因融合,脂质体转染HepG2细胞株,荧光显微镜下观察EGFP-HBVP22e融合蛋白的胞内表达,Western blot检测阳性克隆细胞EGFP-HBVP22e的表达.结果 成功构建了真核表达载体pEGFP-C2HBVP22e,并转染HepG2细胞,经多次传代培养鉴定,获得稳定表达EGFP-HBVP22e融合蛋白的HepG2细胞系.结论 该细胞系的建立为进一步研究HBVP22e的生物学功能与乙型肝炎发病机制的关系奠定了基础.